ODNan技术是近年认识的在作用方式上不同于反义寡脱氧核苷酸( ODNas)的一种基因表达的调控手段，能与双链DNA分子特异性结合形成局部三螺旋结构，从 而在转录水平抑制基因表达［1，2］。通过三螺旋形成，ODNan充当了切割DNA的“分 子剪刀”，提供了基因治疗的新策略。文献报道ODNan及ODNas在体外能抑制癌基因表达及猿 病毒40复制，但作者尚未见将ODNan应用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)的研究报 道。因此，我们在22.1.5细胞观察了针对HBV核心启动子(HBV Cp)Sp1位点的ODNan及针对HBV 前C、前基因组RNA 5′端起始区的ODNas的抗HBV作用。

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材料与方法(22.1.5细胞培养 硫代磷酸反基因及反义寡核苷酸合成 抗病毒作用检测 细胞毒性试验)

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反基因寡脱氧核苷酸技术

ODNas在体外能抑制HBV复制。ODNas的靶点为RNA，在翻译水平发挥作 用，有一定局限性，若能直接抑制HBV基因转录，则抗HBV效果可能更强。ODNan即不同于ODN as，能与含同聚嘌呤嘧啶序列的双螺旋DNA形成三螺旋结构而直接在转录水平发挥抑制作用

HBV Cp 1734 nt～1754 nt存在两个转录因子Sp1位点，是决定HBV Cp活性的 重要部位；该区域为同聚嘌呤嘧啶序列[7]，又具有形成三螺旋的结构特点；此外 ，HBV基因功能，复制特点决定了HBV前基因组RNA 5′端起始区可能是HBV反义治疗的最佳靶 点。因此，本文选择这两区域为ODNan、ODNas作用靶点，进行抗HBV研究，尚未见类似的研 究报道。

本研究表明ODNan21、ODNas21能明显抑制HBV复制及抗原合成，并对细胞无毒副作用。其抑 制呈剂量依赖性。两者联合应用时抑制作用增强。由于ODNan21作用于转录水平，ODNas21作 用于翻译水平，因此，两者联合应用时HBV前C、C基因的转录、翻译及HBV复制三个环节均可 能被抑制故作用增强。该结果提示，作用于HBV生活周期不同环节的药物联合应用可能提高 抗HBV效果。

我们设计的ODNan21针对HBV Cp Sp1，作用于转录水平；ODNas21作用于翻译水平。从理论上 看，ODNan21应显示更强的抑制作用。但本实验发现，ODNan21对HBeAg、HBsAg的抑制反略低 于ODNas21。其原因不太清楚，可能与所用实验细胞有关。因为转录因子Sp1对HBV Cp活性的 调控呈细胞特异性。在去分化细胞，如Hep G2.1细胞系，Sp1的调控作用较强；而在分化细 胞 ，如Hep G2细胞系(包括22.1.5细胞)，Sp1对HBV Cp的调控作用较弱[9]，因此，在 2 2.1.5细胞，即使应用ODNan21封闭了Sp1，对HBV基因表达及复制的抑制也可能不很强。可以 推测，在正常分化的肝细胞中，ODNan21可能显示出更强的抗HBV作用。

本研究显示，ODNan及ODNas能有效抑制HBV复制，这无疑为乙型肝炎的治疗提供了新思路。 但这仅是体外的初步研究结果，如何降低合成寡核苷酸的成本；如何将ODNan、ODNas定向导 入肝细胞及明确其在动物体内的药效、药代动力学等将是今后急需研究的课题。

材料与方法

22.1.5细胞培养

22.1.5细胞为转染了HBV(ayw亚型)全基因组，能分泌HBsAg、HBeAg、HBV DNA及HBV颗粒的人 肝母瘤细胞系[6]，由第一军医大学骆抗先教授惠赠。用含10%胎牛血清及G418(400 μg/ml)的DMEM(Sigma公司产品)培养基按常规方法培养。

硫代磷酸反基因及反义寡核苷酸合成

选择HBV(ayw)Cp Sp1位点(1734 nt～1754 nt)设计21聚反基因寡核苷酸(ODNan21)，序列为T GTGGTGGGGAAGTGGTGGG；以HBV前C、前基因组RNA 5′端起始区(1813 nt～1833 nt)设计21聚 反 义寡核苷酸(ODNas21)，序列为CAGAGGTGAAAAAGTTGCATGGT；无关序列对照寡核苷酸(ODNcon) ，序列为GGGTGGTGAAGGG-GTGGTGT。采用固相亚磷酰胺三酯合成法在DNA合成仪(美国AB I公司)上由中国科学院上海细胞生物学研究所协助合成。

抗病毒作用检测

将22.1.5细胞以2×105 个/孔接种于24孔培养板，同时加入不同剂量ODNan21、ODNas21及 ODNcon,12 h再给药1次继续培养，每个浓度做3个复孔。空白对照细胞仅加培养基。每12 h 收集50 μl培养上清液，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)(中山生物公司试剂盒)一次性检 测HBsAg、HBeAg含量，结果以P/N值表示，按下式计算抑制率：

抑制率=(对照孔P/N-实验孔P/N)÷(对照孔P/N-2.1)×100%

按常规方法抽提各组细胞培养上清液中HBV DNA，以地高辛标记的HBV DNA探针采用斑点杂交 法探针检测其HBV DNA水平。

细胞毒性试验

22.1.5细胞传代培养24 h后，换含不同浓度ODNan21的培养液，每个浓度接种3孔。设不加OD Nan21的22.1.5细胞作对照。继续培养72 h，采用放射免疫法检测培养上清中甲胎蛋白水平 ，并观察细胞生长情况、细胞形态、细胞破坏程度。