概述

〔PCR原理〕

〔PCR步骤〕

〔PCR检测〕

PS:

概述

聚合酶链式反应（PCR）：扩增样品中的DNA量和富集众多DNA分子中的一个特定的DNA序列的一种技术。在该反应中，使用与目的DNA序列互补的寡核苷酸作为引物，进行多轮的DNA合成。其中包括DNA变性，引物退火和在Taq DNA聚合酶催化下的DNA合成。

DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现 ，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

〔PCR原理〕

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时由于两条链之间的氢键被破坏也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复形成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

〔PCR步骤〕

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。

2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳，也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

〔PCR检测〕

PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴乙锭）染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

PS:

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ,PCR）

三步：

1 变性：模板DNA加热变性

2 退火 引物与它的靶序列发生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成杂交链

3 延伸 4种dNTP 与 Mg2+ 存在的条件下，DNA合成酶催化以引物为起始点，按5'-3'方向进行延伸。

上面三步为一个循环，可使拷贝数到达2*Ｅ－6-2*Ｅ－7

PCR 产物一段双链DNA，是由它的末端引物的5’端决定的。

1.首轮扩增，其产物是大小不均一的DNA分子。长度应大于两引物之间的长度。

在第二个循环中，如图3，由于5'固定，其产物长度就由等于两引物之间的长度。所以几十个循环后就会产生大量的两引物之间序列。

引物设计：

1，长度15~30个核苷酸，最多到50个核苷酸左右。（50？为什么？反正太长也没有必要）

2, 尽量避免嘌呤和嘧啶堆积的现象。（其实有时很难避免，不是很重要）。

3,引物内部不应该形成二级结构，如果引物中有酶切位点时，就会出现引物二聚体。（一般不是很重要）

PCR的反应条件

１，dＮＴＰ浓度过高会加快反应速度，但同时还可以增加碱基的错误掺入率。

２， 引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。

３，ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增，低则合成产物量减少。

ＴａｑＤＮＡ聚合酶无校正功能，掺入错误率达2*E-4个核苷酸，一个３０个循环的扩增反应0.1％-0.25％总错误率。

４， 在９０～９５度下可使整个基因组的ＤＮＡ变性为单链。一般９４～９５度３０～６０s。时间过长使ＴａｑＤＮＡ聚合酶失活和dＮＴＰ破坏增多。

５，ＤＮＡ很快冷却到４０～６０度使引物和模板结合。引物长度在１５～２５时退火温度

Ｔｍ＝４（Ｇ＋ｃ）＋（Ａ＋Ｔ），一般在４５～５５度，温度低容易退火但特异性低；温度高，不容易退火但特异性高。退火时间３０秒。

６，延伸温度一般在７０～７５度这时ＴａｑＤＮＡ聚合酶活性最高（１５０个／Ｓ），当引物在１６个碱基以下时可采用缓慢升高温度到７０～７５度的方法，使在低温下就开始合成。一般<１ＫＢ时间１分钟即可。当〈１ＫＢ时在较后的循环中延长扩增时间。

７：循环次数２５～３０次。

无产物时：

１，取１０ul扩增混合液作模板在进行ＰＣＲ扩增。

２，增加ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度

３，增加循环次数

４，降低退火温度

５，加靶ＤＮＡ量