定义

目的基因的制备(（一）从细胞核中直接分离 （二）染色体DNA的限制性内切酶酶解 （三）人工体外合成 （四）用逆转录酶制备cDNA （五）从基因文库中获取 （六）PCR技术扩增)

基因的制备流程

定义

一、目的基因的定义：把需要研究的基因称为目的基因。（一般把需要分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。）

目的基因的制备

（一）从细胞核中直接分离

简单的原核生物目的基因可从拟核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法中得到。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。

用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。

（二）染色体DNA的限制性内切酶酶解

II型限制性内切酶可专一性地识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端。若载体DNA与插入的DNA片段用同一种内切酶消化，或靶DNA与载体DNA末端具有互补的粘性末端，可以直接进行连接。

（三）人工体外合成

简短的目的基因可在了解DNA一级结构或多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列的基础上人工合成。

（四）用逆转录酶制备cDNA

大多数的目的基因是由mRNA合成cDNA（反转录DNA）得到。从RNA入手，先从细胞提取总RNA，然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤（polyadenylic acid ,polyA）尾的特点，用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出，以mRNA为模板，在多聚A尾上结合12－18个dT的寡聚dT片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作用下合成第一条。

（五）从基因文库中获取

依据：基因的核苷酸序列，功能，在染色体中的位置，转录产物mRNA，翻译产物蛋白质性质。

（六）PCR技术扩增

基因的制备流程

cDNA链。用碱或RNA酶水解除去mRNA，再用DNA聚合酶，最好是Klenow片段合成第二条DNA链。双链合成后，用S1核酸酶切去发夹结构，即可获得双链cDNA。cDNA用于探针制备、序列分析、基因表达等研究。因此以cDNA为研究材料，反映了mRNA的转录及对以后翻译的影响情况，即反映某一基因（DNA）外显子的情况。