| 词条 | 疏水相互作用层析 |
| 释义 | § 简介 HIC：疏水相互作用层析，是根据不同的生物大分子疏水性的强弱而达到分离纯化的目的。 疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC） 是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。 溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。 疏水相互作用层析根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离蛋白。运行所用缓冲液中的某种盐的存在会显著影响疏水蛋白和疏水层析介质的相互作用。高浓度的盐会增强相互作用，而低浓度的盐减弱相互作用。所有单个蛋白都和疏水相互作用层析介质的疏水表面相互作用，但是，随着缓冲液中里子强度的降低，相互作用逆转了，具有最低程度疏水性的蛋白最先被洗脱。具有最强相互作用的蛋白最后被洗脱，这需要盐浓度降得更低来逆转相互作用。 疏水相互作用层析填料上疏水配基和蛋白质疏水表面相互作用。在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白之间或蛋白自身的相互作用。然而，某些盐能增强疏水相互作用，加入这些盐导致到疏水相互作用的结合（吸附）。对于选择性洗脱，盐浓度逐步的降低，样品组分根据疏水性的依次洗脱。 § 实验一. 疏水作用层析 【实验目的】 通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。 疏水作用层析的基本原理如图所示 【实验原理】 疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。 溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。 Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow结构示意图如下。 【实验材料】 1．实验器材 层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计 2．实验试剂 （1）疏水层析介质：Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow （2）溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.0 （3）溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4 （4）蛋白质样品溶于溶液B 【实验操作】 1. 层析介质准备：Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。 2. 装柱：将层析柱洗净，固定在铁架台上，层析柱下口用螺旋夹夹紧。加入溶液B，打开下口让溶液流出，排出残留气泡，柱中保留高度约2厘米的溶液。将准备好的层析介质轻轻搅匀，用玻璃棒引流，沿层析柱内壁将层析介质缓慢加进柱中。等到层析介质在柱中沉积高度超过1厘米时，打开下口。柱床高度达到6-8厘米时关闭下口，装柱尽可能一次装完，避免出现界面。 3. 柱平衡：用溶液B平衡1-2个床体积。注意始终保持层析介质处于溶液中，不要干柱。 4. 上样：取样品加入平衡好的层析柱，并收集层析柱下口流出组分，调节流速为1ml/min,每管3ml。 5. 洗涤：用溶液B洗涤1个床体积，洗去上样不吸附组分。收集层析柱下口流出成分。 6. 洗脱与收集：梯度混合器左面装入250ml溶液A，右面装入250ml溶液B。按照100%-0%1.7M (NH4)2SO4梯度洗脱500ml，收集洗脱液。 7. 检测：取各收集管样品，280nm处测定紫外吸收。 8. 疏水层析介质清洗与保存：层析介质先用水清洗，然后用0.5MNaOH洗脱，最后用水洗至中性。处理好的层析介质放在20%乙醇中，4℃保存。 【实验结果】 以各个收集管的管号为横坐标，280nm处紫外吸收值为纵坐标作图，得到洗脱曲线。分析实验结果并讨论。 § 相关条目 生物 化学 分子 微生物 |
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