测定根系活力（TTC法）(原理 试剂 方法)

种子生活力快速测定?(原理?? 试剂 方法?)

花粉活力的测定(原理 试剂 方法)

测定根系活力（TTC法）

原理

氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化还原电位为80mV的氧化还原物质，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲 （TTF），如图。 生成的TTF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。仪器与用具??　分光光度计；分析天平（感量0.1mg）；恒温箱1台；研钵1套；100ml三角瓶；漏斗；移液管10ml 1支、2ml 1支、0.5ml 1支；20ml刻度试管；10ml容量瓶；小培养皿；试管架，药匙；石英砂适量。

试剂

乙酸乙酯；

连二亚硫酸钠（Na2S2O4，为强还原剂，俗称保险粉）；

1%TTC溶液：准确称取TTC 1.0g，溶于少量蒸馏水中，定容至100ml；

0.4%TTC溶液：准确称取TTC 0.4g，溶于少量蒸馏水中，定容至100ml；

磷酸缓冲液（1/15mol/L，pH7.0）；

1mol/L硫酸：用量筒量取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml；

0.4mol/L琥珀酸钠：称取琥珀酸钠（含6个结晶水）10.81g，溶于蒸馏水中，定容至100ml。

方法

1.定性测定

（1）配置反应液 把1%TTC溶液，0.4moL/L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。

（2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除，将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。

2.定量测定

（1）TTC标准曲线的制作

吸取0.25ml 0.4%TTC溶液放入10ml容量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定光密度，绘制标准曲线。

（2）称取根样品0.5g，放入小培养皿（空白试验先加硫酸再加入根样品，其他操作相同），加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗处保温1h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。

（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。把红色提出液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查标准曲线，求出四氮唑还原量。

（4）计算

将所得数据带入下式，求出四氮唑还强度。

种子生活力快速测定?

原理??

有生活力的种子能够进行呼吸代谢，在呼吸代谢途径中由脱氢酶催化所脱下来?的氢酶催化所脱下来的氢可以将无色的2,3,5-三苯基氯化四唑还原为红色、不溶性的甲月替，而且种子的生活力越强，代谢活动越旺盛，被染成红色的程度越深，死亡的种子由于没有呼吸作用，因而不会将TTC还原为红色。种胚生活力衰退或者部分丧失生活力，则染色较浅或局部被染色。因此，可以根据种胚染色的部位以及染色的深浅程度来判定种子的生活力。

试剂

0.5%TTC溶液；TTC溶液最好随用随配，不宜久藏。溶液应遮光贮藏。若已经变为红色，则不能继续使用。

方法?

1.浸种

将种子用温水（30～?35℃?）浸泡2～6h，使种子充分吸胀。

2.显色

随机取吸胀种子20粒，小心剥去种皮，务必不要伤害种胚。然后将处理好的种子置于小白瓷碗中，加入0.5%TTC溶液，以刚好浸没水中煮5min后，再加入0.5%TTC溶液染色。

3.统计

染色结束后要立即进行鉴定，因放置太久会褪色。倒出TTC溶液，再用清水将种子冲洗1～2次，观察种胚被染色的情况。凡种胚全部或大部分被染成红色的即为具有生活力的种子，种胚不被染色的为死种子。根据上述标准鉴定煮沸和未煮沸种子的生活力。

花粉活力的测定

原理

根据有活力的花粉粒在呼吸过程中产生氧化还原反应，无活力的花粉粒无此反应。当TTC渗入有活力的花粉粒内，并作为氢受体被脱辅酶上的氢还原时，便由无色的氯化三苯四氮唑（TTC）变为红色的三苯基甲唑（TTF）（适用作新鲜花粉经干燥等加工处理后的活力指标，对陈旧不新鲜的花粉，这一指标的变化另当别论）。

试剂

0.5%TTC溶液（称取TTC 0.5克放入烧杯中加入少许95%酒精使用溶解，然后用蒸馏水稀释至100毫升。溶液避光保存，溶液发红时，不能再用）

方法

1.取少许花粉置于载玻片上，加1~2滴TTC溶液，盖上盖玻片。

2.将制片放入30℃恒温箱中放置15分钟。然后在显微镜下观察。凡被染为红色的活力强；淡红色的次之；无色者没有活力的花粉。

3.观察2~3个制片，每片取5个视野，统计100粒，然生计算花粉的活力百分率。