应用物理或化学方法，除掉或抑制血液中的某些凝血因子，阻止血液凝固，称为抗凝。能够阻止血液凝固的化学试剂或物质，称为抗凝剂或抗凝物质。 如天然抗凝剂（肝素，水蛭素等） Ca+2鳌合剂（柠檬酸钠，氟化钾）

基本信息

种类(乙二胺四乙酸 草酸钠 肝素 枸橼酸钠)

临床应用(EDTA 肝素 枸橼酸盐)

配制(EDTA 肝素 枸橼酸钠 草酸钾)

原理

基本信息

抗凝剂

医疗用途：治疗静脉炎，阻止血块在静脉里形成。

体育用途：避免促红细胞生成素使血液变稠。

应用物理或化学方法，除掉或抑制血液中的某些凝血因子，阻止血液凝固，称为抗凝。能够阻止血液凝固的化学试剂或物质，称为抗凝剂或抗凝物质。

如天然抗凝剂（肝素，水蛭素等）

Ca+2鳌合剂（柠檬酸钠，氟化钾）

原理：使凝血酶原不能激活，Ca+2是凝血因子IV，其他的是蛋白类》.

种类

乙二胺四乙酸

乙二胺四乙酸（EDTA）盐 EDTA有二钠、二钾和三钾盐。均可与钙离子结全成螯合物，从而阻止血液凝固。

EDTA盐对红、白细胞形态影响很小，根据国际血液学标准公委员会（International committee standard of hematology ,ICSH）1993年文件建议，血细胞计数用EDTA二钾作抗凝剂，用量为EDTA-K2。2H2O1.5-2.2MG （4.45±0.85μmol）/ml血液。EDTA-NA与EDTA-K2对血细胞计数影响均较小，但二钠溶解度明显低于二钾，有时影响抗凝效果，其他抗凝剂不适合于血细胞计数。表1-1是几种抗凝剂对白细胞计数的影响，EDTA影响小板聚集，不适合于作凝血象检查和血小板功能试验。

草酸钠

草酸钠（sodium oxalate）草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固。

肝素

肝素（heparin）肝素广泛在于肺、肝、脾等几乎所有组织和血管周围肥大细胞和暑碱性粒细胞的颗粒中。它是一种含硫酸基团的粘多糖，是分散物质，平均分子量为15000（2000-40000）。肝素可加强抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）灭活丝氨酸蛋白酶，从而具有阻止凝血酶形成，对抗凝血酶和阻止血小板聚集等多种作用。每毫升血液抗凝需要持素15±2.5IU 。尽管肝素可以保持红细胞的自然形态，但由于其常可引起白细胞聚集关使用涂片在罗氏（）染色时产生蓝色背景，因此肝素抗凝血不适全血液学一般检查。肝素是红细胞透渗脆性试验理想的抗凝剂。

枸橼酸钠

枸橼酸钠（trisodium citrate）枸橼酸盐可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固。

枸橼酸钠有2Na3C6H5O7。和2Na3C6H5。11H2O等多种晶体。通常用前者配成109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用，使其活性减低缓，故常用于凝血象的检查，也用于红细胞沉降率的测定。因毒性小，是输积压保养中的成分之一。

临床应用

EDTA

EDTA是临检工作中最常用和最重要的抗凝剂和试剂之一，其机制是通过与水相中的钙离子形成稳定的螯合物而阻止血液凝固。EDTA的盐类有钾、钠、锂盐、均溶于水，钾盐较钠盐的溶解度大，全血胞计数最好使用EDTA的钾盐。EDTA能影响某些酶的活性和抑制红斑狼疮因子，故不适于制作组化染色和检查红斑狼疮细胞的血涂片。EDTA还会影响血小板聚集和白细胞吞噬功能，也不适于做止血学检验和血小板功能检验。用EDTA抗凝血制备的涂片对粒细胞形态有影响，其影响程度与抗凝血放置时间和抗凝剂浓度有关。按照ICSH建议EDTA的使用浓度为1.4～1.6g/L血液，迅速制备涂片，粒细胞形态特征有微小的改变，有时细胞核分叶不见，细胞肿胀。如果用放置时间较长的血液制备的涂片可出现细胞浆内颗粒消失，胞浆和细胞核有空泡，染色质模糊不清。用大于1.5g/L血液浓度制备的血涂片，粒细胞可完全变性，对淋巴细胞和单核细胞也有影响，尤其是血小板，可出现肿胀、破裂而产生碎片，影响其计数，造成结果偏高。获得血浆标本可通过不同的抗凝剂，肝素锂作为抗凝剂在国外应用广泛，而国内多使用肝素钠、EDTA-K2抗凝，与国外有所不同。随着临床医学的发展，近年来糖化血红蛋白检测项目的开展，也使用了EDTA-K2作为抗凝剂，从而减少了对结果的影响。

肝素

肝素是血液化学成分测定中最好的抗凝剂。肝素是一种含硫酸基团的黏多糖，分子量为1.5万，其抗凝机制是与抗凝酶Ⅱ一起，在低浓度能抑制因子Ⅸa、Ⅷ和PF3之间的作用，并能加强抗凝血酶Ⅲ灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成；还有抑制凝血酶的自我催化及抑制因子X的作用。肝素的盐类有钠、锂、铵盐。通常用肝素抗凝的剂量是10.0～12.5IU/mL血液。临床常用肝素锂，虽其价格较贵，但抗凝效果较好。因为肝素钠能增加血浆钠的含量，而肝素铵能增加尿素氨的含量。某些生化成分在血清和肝素抗凝的血浆中有明显的区别。在凝血过程中由于红细胞的溶解破坏使血清钾的含量比血浆为高，由于血浆中含有Fg，其含量比血清高。因此，测定钾离子时，注意血清与血浆之间的差异。另外肝素过量可引起白细胞聚集和血小板减少，故不适于白细胞分类和血小板计数，更不能用于止血学检验。通过试验表明，采血时加入肝素钠抗凝剂后，对测定血液中总蛋白质含量结果有较明显的影响，会使其测得结果高于用血清测得总蛋白质3%～5%。但加入了抗凝剂后，其总蛋白含量低于血清总蛋白质含量，其原因是血液加入肝素钠抗凝剂后，阻断了凝血活酶的生成，阻止了血液凝固，导致纤维蛋白原不能水解转化成纤维蛋白单体，有效阻止了纤维蛋白单体的形成，这些纤维蛋白原仍留在血浆中。而血清是血液经凝固后，纤维蛋白原水解转化为纤维蛋白单体，并因凝固而消耗，离心后随血细胞一并分离出去了。因此，血浆中的总蛋白质量是包含了纤维蛋白原在内的所有蛋白质，而血清中是不含有纤维蛋白原的总蛋白质含量，理论上应该低于血浆中的总蛋白含量。因此在进行血液总蛋白质含量测定时，最好以血清为标本，对一些急诊标本，或是一些因其他原因急需测定的患者，需要用血浆做标本测定总蛋白时，在测出总蛋白后，应扣除纤维蛋白原的含量（一般扣除3%～5%），这样才能与以血清为标本测得的总蛋白含量一致，真实反映患者体内实际总蛋白质之含量。

枸橼酸盐

枸橼酸盐主要用于止血学检验及血沉的测定。因其毒性小，也用于输血保养液中。其抗凝机制是枸椽酸盐与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固，其反应式为Na3C6H5O7+Ca2+→CaC6H5+3Na+。其盐类主要是钠盐。枸缘酸钠有Na3C6H5O7ZH?5O和2Na3C6H5O7+1H2O2种晶体，通常用前者配制0.129 mol/L(3.8%)或0.109mol/L（3.2%）的血溶液，与血液按1:9使用。对于用于监测口服华法令等抗凝剂治疗的患者，测定PT、APTT所用的枸缘酸钠浓度（3.2%或3.8%）不应随意改变，因为可能影响到国际标准化比值（INR）。一般用浓度0.129mol/L的枸缘酸钠比用0.109mol/L浓度时INP值要高些，另外对不同来源的凝血活酶试剂，对同一正常人或患者血浆的凝固时间可以相差很大。因此每个实验室所使用的凝血活酶试剂的来源应尽可能恒定，配制操作方法应规范化，否则会使凝固时间延长或缩短，或使正常值无规律性。有条件的实验室可采用缓冲抗凝剂，这种试剂对标本经冷冻保存后再进行分析更为适宜。缓冲剂的作用是维持血浆恒定pH值，防止易变因子失活。

配制

EDTA

常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固。

肝素

1%肝素溶液0.1ml于试管内，旋转试管，使溶液均匀浸湿试管内壁，放入80～100℃烘箱烤干，每管能使5～10ml血液不凝。急性血压实验时可在充满生理盐水的动脉套管内注入肝素20～25mg。体内抗凝：500～1000u/kg。 市售的肝素注射液每1ml含肝素12500u（相当于肝素钠125mg，即1mg相当于100u）。应置冰箱内保存。

枸橼酸钠

枸橼酸钠 3.8%的枸橼酸钠溶液1份可使9份血液不凝，用于红细胞沉降速率的测定。因其抗凝血作用较弱而碱性较强，不适用于供化验用的血液样品。做急性血压实验时则用5～7%的枸橼酸钠溶液。

草酸钾

草酸钾常用于供检验用血液样品的抗凝。在试管内加饱和草酸钾溶液2滴（或10%溶液0.2ml），轻轻敲击试管，使溶液分散到管壁四周，置80℃以下的烘箱中烤干（烘烤温度过高，可使草酸钾分解为碳酸钾而失效），每管能使3～5ml血液不凝。供钾、钙含量测定的血样不能用草酸钾抗凝。

关于保存：新鲜冰冻血浆在-20℃以下可保存1年

原理

使凝血酶原不能激活，Ca+2是凝血因子IV，其他的是蛋白类》. 离心技术是根据颗粒在匀迷圆周运动时受到一个外向的离心力的行为发展起来的一种分离分析技术。

1．用于工业生产的，如化工、制药、食品等工业大型制备用的离心技术，转速都在每分钟5000转以下。 2．用于生物、医学、化学等实验室分析研究的，转速从每分钟几千到几万转以上，此类技术的使用目的在于分离和纯化样品，以及对纯化样品的有关性能进行研究。

一、基本原理

1．离心力Centrifugal force (F) F=mω2r ω：旋转角速度(弧度/秒) r:旋转体离旋转轴的距离(cm) m：颗粒质量

2．相对离心力 Relative centrifugal force (RCF) RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数 RCF=F离心力/F重力 = mω2r/mg= ω2r/g g为重力加速度(980．70g/sec2) 同为转于旋转一周等于2π弧度，因此转子的角速度以每分钟旋转的次数(每分钟转数n或r/min)表示： 一般情况下，低速离心时常以r/min来表示，高速离心时则以g(或数字Xg)表示。 用“X g”表示每分钟转速可以真实反映颗粒在离心管不同位置的离心力。Dole&Cotzias制作了转子速度和半径相对应的离心力列线图(图2—15)。

3．沉降系数 Sedimentation coefficient (S) 当转子内样品绕着旋转轴离心时，样品沉降率是由样品颗粒的大小、形状、密度和溶剂的粘度、密度以及离心加速度决定的，在一般情况下，样品的沉降特征可以用沉降系数来表示： S：是指单位离心场中粒子移动的速度。 S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的时间。 S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，单位为秒，1S二1×10-13秒。对一定的样品，在一定的介质中，样品沉降系数S也常保持不变。文献中常用沉降系数以描述某些生物大分子或亚细胞器大小。

二、离心设备 离心技术所使用的设备是由离心转子、离心管及附件等组成。

(一)离心机

1. 低速离心机 一般最高转速在6000r/min以下。实验室中常用于分离制备。

2．高速离心机 带有能够冷却的离心腔制冷设备，这类离心机的速度控制比上述的低速离心机来得准确，工作时的实际速度和温度可通过仪表显示；配有一定类型及规格的转子，可根据需要选用。此类离心机的最高转速在25000r/min以下，常用于生物大分子的分离制备。

3．超速离心机 由四个部分组成，即驱动和速度控制；温度控制；真空系统以及转于。至今超迷离心机最高转速为85000-/min(可达600，000g左右)。常用于分离亚细胞器、病毒粒于、DNA、RNA和蛋白质分于，在分离时无须加入可能引起被分离物质结构改变的物质，故为观察它们的“天然”结构与功能提供了手段。

(二)转子 主要有三种： 固定角式转子(fixed—angle rotor)；水平转子(swing—out rotor)；垂直转子(vertical rotor)，还有带状转子(zonal rotor)和连续转于(continuous rotor)等。

1．固定角式转子

离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度，角度变化在14—40°之间，常见的角度有20°、28°、34°及40°等。 因角式转子的重心低，转速可较高，样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径；又因为有一定的角度，故在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀，这就是“管壁效应”，此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。

2．水平转子

此类转于静止时，处在转子中的离心管中心线与旋转轴平行，而在转子旋转加速时，离心管中心线由平行位置逐渐过渡到垂直位置，即与旋转轴成90‘角，粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本一致，但也有少量的“管壁效应”。 由于此类转予的重心位置较高，样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径。它对于多种成分样品分离特别有效，常用于速率区带离心和等密度离心。

3．垂直转子

离心管垂直插入转于孔内，在离心过程中始终与旋转轴子行，而离心时液层发生90°角的变化，从开始的水平方向改成垂直方向，转子降速时，垂直分布的液层又逐渐趋向水平，待旋转停止后，液面又完全恢复成水平方向。这是因为在进行密度梯度离心前，由于重力的作用，垂直转予的粒子沉淀距离等于离心管的直径，离心分离所徭的离心力最小，适用于速率区带离心和等密度离心，但一般不用于差速离心。

三、离心分离方法

根据离心原理，按照实际工作的需要，目前已有可设计出各种离心方法综合起来大致可分三类

1. 平衡离心法

根据粒子大小、形状不同进行分离，包括差速离心法(differential velocity centrifugation)和速率区带离心法(rate zonal centrifugation)。

2．等密度离心法(isopynic centrifugation)

又称等比重离心法，根据粒子密度差进行分离，等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法。

3．经典式沉降平衡离心法

用于对生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化。

(一)差速离心法

它利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。操作过程中一般是在离心后倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。 差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。

2．注意点：

①可用角式、水平式转头

②可用刹车

③难以获得高纯度 例：用差速离心法分离已破碎的细胞各组份

(二)速率区带离心法

1．原理

速率区带离心法是离心前在离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。离心后在近旋转轴处的介质密度最小，离旋转轴最远处介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒于的最小密度。这种方法是根据分离的粒子其在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。 梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。 该离心法的离心时间要严格控制，即有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任意一个粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。

2．注意点：

①严格控制离心时间

②粒子密度大于介质密度

③样品事先配制在较平缓的连续密度的梯度溶液

④不能用角式转头、只能用水平式转头

⑤不能用刹车

(三)等密度离心法

1．原理

等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒子上浮；在弯顶处粒子密度大于介质密度时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密变，此时dr/dt为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。

2．注意点：

①离心时间要长

②可用角式转头或水平式转头

③粒子密度相近或相等时不宜用

④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度

⑤不能用刹车

四、梯度溶液的制备

(一)梯度材料的选择原则：

1．与被分离的生物材料不发生反应，且易与所分离的生物材料分开。

2．可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。

3．不会对离心设备发生腐蚀作用。

4．容易纯化，价格便宜或容易回收。

5．浓度便于测定，如具有折光率。

6．对于分析超迷离心工作来说，它的物理性质，热力学性质应该是己知的。

(二)梯度材料的应用范围 下面简单介绍几种常用的密度梯度材料的性质及其应用范围。

1．蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1．33g/ml，且由于价格低，容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。

2．聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll—400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。

3．氯化铯：是一种离于性介质、水溶性大，最高密度可达1．91g/nd。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。

4．卤化盐类：KBr和NaCI可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。

5．Percoll: 是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮(PVP)，渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的。其粘度高，在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。

五、分析性超速离心

与制备性超速离心不同的是：分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组分。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。

分析性超速离心的工作原理： 分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子，一套真空系统和一套光学系统所组成。该转子通过一个柔性的轴联接一个高速的驱动装置，这轴可使转于在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳二个小室：分析室和配衡室有上下二个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收(如对蛋白质和DNA)或折射率的不同对沉降物进行监视，后一方法的原理是：当光线通过一个具有不同密度区的透明液时，在这些区带的界面上产生光的折射。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就象一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产生一“峰”。由于沉降不断进行，界面向前推进，故“峰”也在移动，从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标.