以往研究基因表达差异的方法主要有: 蛋白质双向电泳、cDNA 减法杂交和mRNA 差示技术( 简称DD2PCR )。蛋白质双向电泳只能粗略地比较两种细胞内产生的蛋白质, 不能直接从基因水平分析鉴定, 因而很难推广; cDNA 减法杂交需建立cDNA 文库, 通过两次杂交分离去除双链分子, 再将余下的单链分子同文库进行杂交, 这种方法不仅技术复杂、费时, 而且重复性差;

改进过程

发展过程

基本方法

改进过程

L ing 在1992 年建立的mRNA 差示技术具有快速、简便、敏感等优点, 但存在着假阳性高的缺点, 目前, 国内学者利用这种方法筛选出真正意义的cDNA 片段并不多。1993 年, L isit syn 等建立了representational difference analysis (RDA ) 方法, 它可以筛选出两个基因组之间的差异基因或基因片段。受Lisit syn 的启发, 1994 年Hubank和Schatz 建立了cDNA [representat ional difference analysis (cDNA RDA )]方法, 可以筛选mRNA 的差异表达, 具有快速、敏感、重复性好、假阳性率低、不需同位素等优点。

发展过程

分别提取处理组(A ) 与对照组(B) 的RNA 或mRNA , 反转录成cDNA , 用识别4 个碱基的内切酶DpnÊ (M boÉ ) , 将两组适量的cDNA 充分酶切, 再经PCR 扩增, 即得到每一个样品的呈现性片段, 所得到的混合物称为扩增子, 接着扩增子经过连续数次的扣除交叉杂交、动力富集并进行差异PCR 扩增, 使试验者 (处理组作为Tester) 群体中存在, 而在驱动者(对照组作为D river) 中不存在的片段迅速得到富集, 最终筛选出差异片段。

基本方法

其基本方法如下。

(1) 引物设计。

R 12 5’2 GA TCTGCGGTGA 23’

R 24 3’2 ACGCCACTCTCCGACCTCTCACGA 25’

J 12 5’2 GA TCTGTTCA TG23’

J 24 3’2 ACAA GTACCTA TCA GCTGCA GCCA 25’

N 12 5’2 GA TCTTCCCTCG23’

N 24 3’2 AA GGGA GCCTA TCGTGTCAACGGA 25’

DpnII 酶切双链cDNA 产生粘性末端, R 24 和R12、J 24 和J 12、N 24 和N 12 退火后两两互补可形成DpnII 的酶切位点。3 对接头(引物) 中, 1 对(可用R24、R 12) 制备扩增子, 另外2 对用于杂交和扩增的过程中。在相连的两轮PCR 反应中, 不能使用相同的1对接头, 否则上轮反应中未酶切完全的非靶序列(非差异片断) 仍会部分扩增, 从而影响靶序列的纯度。

(2) 提取处理组和对照组的mRNA , 反转录成cDNA。

(3) 用识别4 个碱基的内切酶Dpn II(M bo I) 在37℃将两组双链cDNA 充分酶切。

(4) 纯化经Dpn II酶切的cDNA , 加入R24、R12 及DNA 连接酶连接。

(5) 以R24 为引物分别扩增处理组和对照组。

(6) 纯化扩增产物分别用Dpn II 充分酶切, 切掉R24 的接头, 即得到扩增子作为D river。

(7) 更换接头, 连接J 24、J 12 到扩增子, 建立1 个试验者群体。

(8) Tester以1∶100 分子比例与D river 混合, 在95～ 96℃变性4 m in, 67℃杂交至少21 h, 在两cDNA 群体间成对比较(例如群体A →B) , 同时作A →B 和B→A 两种比较效果更好。杂交有TesteröD river、D riveröD river、TesteröTester 3 种结果。

(9) 用J 24 引物PCR 扩增, TesteröD river 杂交体只能以单引物扩增, 产物数量呈线性递增, 产物均为单链DNA , TesteröTester 杂交体可以被扩增, 分子数呈指数递增, 且为dsDNA 分子, D riveröD river 杂交体由于没有J 24 引物退火区域, 不能进行PCR 扩增, 产物用M ung Bean N uclease 处理, 去除单链DNA 分子, 差异cDNA 完成了第一轮富集。

(10) 第一轮富集产物用Dpn II 酶切掉R 24 接头连上N 12、N 24 接头, 按1∶400 比例与D river 杂交、扩增,M ung BeanN uclease 消化单链DNA , 实现第二轮差异cDNA的富集, 如实验需要可进行第三、四轮杂交(1 ∶800)。

(11)No rthern b lo t 分析, 排除假阳性片段, 来自差异cDNA 的片段进行克隆, 检测表达分析。