百科名片

真菌定义

ITS定义

真核生物核糖体RNA（rRNA）结构

ITS鉴定的原理

应用举例

ITS 鉴定的方法学

局限性

百科名片

ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。

英文：Internal Transcribed Spacer Identification

应用：真菌种属鉴定

真菌定义

一类单细胞或多细胞微生物。不含叶绿素，大都能形成硬的多糖细胞壁。属于真核生物，最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也包括霉菌和酵母。现在已经发现了七万多种真菌，估计只是所有存在的一小半。大多真菌原先被分入动物或植物，现在成为自己的界，分为四门。

ITS定义

ITS（Internal Transcribed Spacer）：内转录间隔区。是真菌核糖体RNA（rRNA）基因非转录区的一部分。用于真菌鉴定的ITS序列通常包括ITS1、5 .8 S 和ITS2。真菌ITS 区域长度一般在650 ～750 bp( 碱基对)。

真核生物核糖体RNA（rRNA）结构

成真核生物核糖体RNA( rRNA) 有5 、5 .8 、17 ～18( 以下统称为18 S) 和25 ～28 S( 以下统称为28 S) 。对于大多数真核生物来说, 核糖体rRNA 基因群的一个重复单位( rDNA) 包括以下区段( 按5′→3′方向) : ①非转录区( Non Transcribed Sequence), 简称NTS ; ②外转录间隔区( External Transcribed Spacer), 简称ETS ; ③18 S rRNA 基因, 简称18 SrDNA ; ④内转录间隔区1( Internal Transcribed Spacer 1) , 简称ITS1 ; ⑤5 .8 S rRNA基因, 简称5 .8 SrDNA; ⑥内转录间隔区2 , 简称ITS2 ; ⑦28 SrRNA 基因, 简称28 S rDNA。ITS1 和ITS2 常被合称为ITS, 并且5 .8 S RNA 基因也被包括在ITS 之内。核糖体内转录间隔区包含2 个不同的非编码区域, 即ITS1 和ITS4 。ITS 序列在物种属内、近缘属间乃至科内系统进化关系研究中有一定的价值。真菌核糖体基因由小的亚单元( 18 S) 、ITS1 区、5 .8 S 区、ITS2 区和大的亚单元( 28 S) 构成, 头尾串联形成重复序列, 一个基因组内有60 ～200个拷贝。

ITS鉴定的原理

rDNA 上的5 .8 、18 和28 SrRNA 基因有极大的保守性, 即存在着广泛的异种同源性。而由于ITS 区不加入成熟核糖体, 所以ITS 片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小,因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性, 即使是亲缘关系非常接近的2 个种都能在ITS 序列上表现出差异, 显示最近的进化特征。研究表明,ITS 片段的进化速率是18 S rDNA 的10 倍。这就是ITS 序列在微生物种类鉴定和群落分析的理论基础。ITS1 和ITS2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一致, 种间差异比较明显。这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。由于ITS 的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异, 此外ITS 序列片段较小、易于分析, 目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中。ITS 的序列分析还有效地解决Lenti nul a 、Suill us 、Tuber 、Cer at ocystis 和Oi diodendron等真菌应用形态学特征进行分类所引起的纷争, 弥补了传统分类上的一些不足。

应用举例

Yan 等利用ITS 序列分析和比较形态学研究了被一些人认为是同种异名的Phi alophoraamericana 和P . verrucose , 得出了它们是不同种的结论。

章桂明根据对小麦印度腥黑粉菌( Tilletia indica) 及其近似种的ITS 序列分析和形态学比较结果, 提出黑麦草腥黑粉菌( T. wal keri ) 与T . i ndi ca 应是同一个种, 建议将黑麦草腥黑粉菌列为我国对外检疫性有害生物。

张正光等对非洲菊根腐病病原疫霉菌的形态特征、致病性及核糖体DNA-ITS 序列进行分析,表明分离菌株与GenBank 中隐地疫霉的ITS 序列的同源性均为99 .87% , 仅有1 个碱基的差异, 进一步明确从非洲菊腐烂病植株根部分离的病原菌为隐地疫霉( Phyt opht hora cryptogea)。

杨雅云等比较了马铃薯、番茄晚疫病菌的核糖体DNA ITS 区段序列的差异, 发现不可交叉的2 类菌株间的同源性为98 .28 % , 可交叉侵染的番茄菌株和马铃薯菌株之间的同源性为99 .17% , 说明相似的序列使得生物学特性也很相似, 反之, 同源性有差异的, 在生物特性上也表现出一定差异。

杨腊英等通过比对所测序的香蕉炭疽菌与GenBank 中炭疽菌属中其他几个种的ITS 全序列, 找出可用于检测香蕉炭疽菌的特异性引物, 为香蕉炭疽菌株的快速、准确检测提供了必要的依据。

ITS 鉴定的方法学

真菌rDNA ITS 序列分析用于真菌系统分类通常通过多聚酶链式反应( PCR) 技术实现。rDNA 多复制的特性, 有利于低浓度或被更高度降解的DNA 样品中ITS区域的扩增。这有利于研究尚无任何rDNA 序列资料的生物。根据这些基因上高度保守区段设计出通用引物, 借助PCR 技术扩增rDNA 的目的片段。PCR 技术在真菌分类、鉴定中与直接测序法相结合有很大的优越性[ 14] : ①只需少量的DNA, 每次扩增只需约0 . 1 ～10 ng ; ②可对DNA 的2 条链测序, 从而减少错误; ③可利用总DNA 的较粗制备品; ④适合于自动测序仪进行测序。

局限性

以ITS 序列作为分子标记的应用技术的最大限制是有的真菌由于进化顺序、变异, 甚至分析方法等原因, 在间隔区上表现的差异性较小, 不适合于属内种及种群的标记。