限制性核酸内切酶（ restriction endonucleases ），简称限制酶，是一类能识别和切割双链 DNA 分子中的某些特定核苷酸序列的核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。根据结构和功能特性，把限制酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型限制酶的切点不固定，很难形成稳定的、特异性切割末端；Ⅲ型限制酶对 DNA 链的识别序列是非对称的，不产生特异性的 DNA 片段，故基因工程实验中基本不用Ⅰ型和Ⅲ型限制酶。

Ⅱ型限制酶的主要作用是切割 DNA 分子，在 DNA 重组、构建新质粒、建立 DNA 的限制性酶切图谱、 DNA 的分子杂交、制备 DNA 的放射性探针、构建基因文库等方面起到重要作用，是基因工程重要的工具酶。

Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是： 一般能识别和切割 4~8 个碱基对的核苷酸序列； 大多数识别序列具有回文结构； 没有甲基化修饰酶功能。

Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式有三种： 切割产生 5 ' 突出的粘性末端（ sticky ends ）； 切割产生 3 ' 突出的粘性末端； 切割产生平头末端（ blunt ends ）。