第一节 制种设备及程序(一、配料称量设备 二、灭菌设备 三、接种设备 四、培养设备 五、制种的程序（工艺流程）)

第二节 菌种培养基的制作(一、一级种培养基的制备 二、二级种三级种培养基的制备)

第三节 灭菌与消毒(一、 干热灭菌 二、湿热蒸汽灭菌 三、消毒)

第四节 菌种的分离、培养(一、 菌种的分离 二、菌种的培养)

第五节 菌种保藏(一、斜面低温保藏法 二、液体石蜡保藏法 三、沙土保藏法 四，真空冷冻干燥保藏法 五、其他保藏方法)

第一节 制种设备及程序

一、配料称量设备

基本器具有试管、菌种瓶、塑料袋、孢子收集器、天平、温度计、湿度计、孢子收集器

试管有多种规格，常用的是21mm×200mm、25mm×200mm。

菌种瓶一般容量是750ml、口径3cm的玻璃瓶，也有用罐头瓶、广口瓶生产的。效果以前种规格为好。但均要求能耐高温、高压，并要无色透明，便于检查菌丝生长和杂菌污染情况。

生产菌种的塑料袋要求用聚丙烯薄膜袋，常用的规格是17cm×34cm。塑料颈圈高3cm，直径3.5cm。用橡皮筋或塑料绳扎口。

药物天平、托盘式天平，称量1000g，感量-1.0g；扭力天平，称量100g，感量0.01g；分析天平，称量100g，感量0.1—1.0g。可根据不同要求选用。

孢子收集器是用来采收菌类孢子的一种装置，包括底盘、培养皿、三角架、纱布及有孔灯罩或钟罩等。

拌料设备主要有拌料机、铁铲等。

装料设备主要有装料机、铁铲等。

二、灭菌设备

主要有灭菌锅。灭菌锅是一个可以密闭并能耐受一定压力的金属锅。锅底（或夹层）盛水，加热后由于锅内（夹层）蒸汽增加而压力加大，温度或高，从而杀死锅内容物的杂菌菌体及孢子，达到灭菌的目的。灭菌锅有两种：

1．高压蒸汽灭菌锅，具有灭菌时间短，效果好，省燃料等优点。缺点是投资较大，目前工厂生产的手提式、直立式、卧式等，也有用钢板自制的。

2．土蒸锅，是自制的常压蒸汽灭菌锅。

三、接种设备

接种设备有接种箱、接种室、超净工作台、负离子发生器

接种箱用木材和玻璃制成，要求密闭。接种箱的前后装有两扇能启闭的玻璃窗，下方开两个小洞口，洞口装有布袖套。箱的大小可自行决定，以方便操作为宜。接种箱结构简单制造方便，成本低，且体积小，便于消毒彻底。

接种室要求密闭、干燥，体积5m3—7m3为宜，外面应设有一间缓冲室，两室的上方要求安装紫外线灭菌灯及日光灯。

超净工作台是利用过滤灭菌的原理，先将空气过滤，得到无菌空气，然后将无菌空气从风洞处打出，使工作台范围内成无菌状态。

负离子发生器是采用强电离对空气进行灭菌的一种新方式。通过电离使用菌体蛋白质和核酸变性死亡，灭菌效果较理想。

四、培养设备

培养设备有培养室、电热恒温培养箱。

培养室是培养菌种的场所。室内装有放置菌种的架子。要求干燥向阳，房间不宜过大，面积20—25m2，以培养5000—6000瓶菌种为宜 。

电热恒温培养箱是采用自然对流通外式的结构，冷空气从底部风孔进入，经电热器加温后，从两侧对流孔间上升，并从内胆左右侧小孔进入内室，再经箱顶的封顶盖调节，使内室温度均恒。

温度计、湿度计。用来观察培养室、栽培室等处温度、湿度、以便根据情况加以调节。常用的有棒形温度计和干湿球温度计。

五、制种的程序（工艺流程）

（一）菌种的概念和类型

在自然界中，食用菌繁衍后代依靠孢子，孢子借风力传播到适宜的环境下，萌发成菌丝体，菌丝体生长繁衍到生理成熟后，在一定的条件下，就可形成子实体。在人工栽培食用菌时，孢子虽然是它的“种子”，但一般不用孢子直接播种（有些为异宗配合），而是用孢子或子实体组织细胞经培养萌发形成的纯菌丝体作为播种材料。

因此，通常所指的菌种，实际上是经过人工培养并进一步繁殖的食用菌的纯菌丝体。

制种是食用菌生产最重要的环节。菌种的优劣，直接影响到食用菌的产量和质量。

优良菌种包含两大方面的含义：一是指菌种本身的生物学特性，如高产、优质、抗逆性强；二是指菌种纯度高、无虫害、无杂菌。因此培育优良的菌种，是提高食用菌生产水平的重要环节。

人工培养的菌种，根据菌种培养的不同阶段，可分为母种、原种和栽培种3类。一般把从自然界中，首次通过孢子分离或组织分离而得到的纯菌丝体称为母种，或称一级种。它是菌种类型的原始种。原始母种通过移接(转管)成数支试管(斜面)种，这些移接的试管种，亦可称为母种。把母种接到木屑、谷粒、棉子壳、粪草等瓶(袋)装培养基上培养而成的菌种称为原种，或称二级种。它是母种和栽培种之间的过渡种。把原种扩接到相同或类似的材料上，进行培养直接用于生产的菌种称栽培种，或称三级种。

（二）制种的程序

食用菌的菌种生产，一般按三级菌种的生产程序，基本上是按菌种分离→母种扩大培养→原种培养→栽培种培养的程序（工艺流程）进行。

第二节 菌种培养基的制作

培养基是用人工方法配合各种营养物质，供给食用菌生长繁殖的营养基质。培养基必须具备三个条件：第一，有食用菌生长所需的物质，如水分和养分，这些物质要有合适的比例；第二，具有一定的生化反应所需的合适酸碱度和一定的缓冲能力，具有合适的渗透压和一定的氧化还原电位；第三，必须经严格灭菌，保持无菌状态。

由于食用菌菌种培育通常采用三级生产，即母钟培育、原种培育和栽培种培育，所以和生产菌种相应用的培养基也可分为三种类型。

一、一级种培养基的制备

马铃薯琼脂培养基。是通用的食用菌母种培养基。其组成是：马铃薯200克、琼脂20克、蔗糖20克、水1000毫升。

按配方组成配制分装于试管里、管口塞棉塞。及时灭菌，灭菌时间不能太长，一般以30分钟即可，以免消毒时间过长会破坏培养料的营养成分，不利于菌丝生长。

消毒结束后立即取出试管斜放于桌面上，做成斜面培养基。挑取2-3支试管放置于250C恒温箱中培养3-5天，若培养基表面没有发现杂菌以及乳白色细菌产生，则表示灭菌彻底，可供扩接母种使用。

二、二级种三级种培养基的制备

原种、栽培种培养基可用相同配方，配制步骤也基本相同。原种由母种繁殖而成，主要用于繁殖栽培种，但也可直接用于栽培生产。

原种、栽培种常用培养基：

① 木屑培养基：木屑78%，麸、糠20%，石膏1%，糖1%，水适量，适用于平菇、木耳、香菇、猴头。

② 棉子壳培养基：棉子壳78.5%，麸、糠20%，石膏1.5%，水适量，适用于平菇、猴头、金针菇、鸡腿菇。

③ 粪草培养基：稻草（切碎）78%，干粪20%，石灰、石膏各1%，水适量，适用于蘑菇，草菇，鸡腿菇，姬松茸。各种培养料应是无霉烂、新鲜、干燥。各种培养基的含水量应保持在60%左右。

将培养料拌匀装入菌种瓶（或袋）内、装料松紧适宜，上下一致，装料高度以齐瓶（袋）肩为宜。然后用锥形木棒在瓶的中央向下插一个小洞，塞上棉塞。装好的料瓶（袋）要当天灭菌，以免培养料发霉变质。

第三节 灭菌与消毒

各种微生物都由蛋白质组成，加热灭菌可以使蛋白质凝固从而达到杀死微生物的目的。加热灭菌经济有效，简便易行，可分为干热灭菌和湿热灭菌两种。

一、 干热灭菌

1、火焰灭菌是直接利用火焰反微生物杀死的方法，它中适用于金属制的工具，玻璃器皿口等物品的灭菌。

2、干热灭菌是利用热空气进行灭菌的方法。灭菌温度140℃—160℃，时间2—3h，它只适用于金属及玻璃器皿的灭菌。电热干燥箱是干热灭菌常用的设备。

二、湿热蒸汽灭菌

1、高压蒸汽灭菌 利用高温高压蒸汽灭菌，是一种最有效、使用最广泛的灭菌方法。蒸汽压力与温度成正比。高压灭菌所采用的蒸汽压力与时间，应根据具体物质而定。

高压灭菌锅的形成与规格较多，有立式、卧式、手提式，能源用电、蒸汽、煤等。

使用高压蒸汽灭菌锅应注意以下几点：

①灭菌锅内的冷空气必须排尽；②灭菌锅内的基质排列一定要稀疏些。使蒸汽流运畅通；③灭菌时升压和降压要缓慢；④灭菌过程应注意保持棉塞干燥。

2、常压蒸汽灭菌法 这是利用自然压力的蒸汽灭菌的方法。可用土蒸锅，蒸茏等灭菌。由于常压，温度较高压的低得多，故灭菌时间要长。其优点是结构简单、成本低、便于自制，适宜于家庭制种。

三、消毒

1、低温消毒法（巴氏消毒法） 一些不耐高温的食品，如牛奶、果子酒、酱油等，需要低温消毒，加热到60℃维持30min，即可杀死食品中的病原菌及多数细菌营养体。

蘑菇培养料的后发酵，就是采用巴氏消毒法，杀死有害于蘑菇的病虫杂菌。

2、沸水消毒法 主要用于针筒等器材的消毒，将有关的器材置沸水中烧煮一定时间，以杀死微生物的营养体。

3、化学药剂消毒法 这是利用化学药剂进行杀菌的方法。杀菌剂的种类及使用浓度：

①重金属盐类：所有的重金属盐类对微生物都有素害作用，如硝酸银、氯化汞等。

②氧化剂：常用的氧化剂有高锰酸钾、过氧化氢、漂白粉、漂白精等，常用的高锰酸钾溶液浓度是0.1%，氯气自来水清洁剂浓度为1ppm，漂白精浓度为400ppm。

③、有机化合物：甲醛（福尔马林）5%甲醛溶液用于种子表面消毒，原液可用于接种箱、培养室、栽培室等空间消毒，熏蒸用量6—10ml/cm3。

新洁尔灭：0.25%新洁尔灭溶液可用作皮肤、种子消毒。

4、干燥消毒 利用干燥使微生物失水，达到杀菌或抑菌的目的，称为干燥消毒。食物、药品等经过适当干燥，便可长时间保存，蘑菇干片即是。

5、渗透压消毒 利用高渗透压杀菌或抑菌的方法称渗透压消毒。在高渗溶液中，微生物细胞由于脱水，质壁分离，不能正常进行新陈代谢而死亡，盐水蘑菇就是利用这一原理制成。

第四节 菌种的分离、培养

一、 菌种的分离

食用菌菌种分离方法有四种，即组织分离法、孢子分离法、耳木分离法和土中菌丝分离法。

（一）组织分离法

组织分离法是利用子实体内部组织来获得纯菌种的方法，根据不同的分离材料大体可分为三种。

1、子实体组织分离

①、种菇的选择 从优良的品系中选取优良的个体作种菇，以单生菇、菇形圆整、无病虫害菇作分离材料。

②分离 把种菇带入接种箱内，用75%酒精表面消毒，用解剖刀在菌柄中部纵切一刀，然后撕开，挑取菌盖与菌柄交界处的一小块组织，接种到PDA培养基上，数天后就可看到组织块及培养基上有白色菌丝，即表明分离成功。

2、菌核组织分离 茯苓、猪苓、雷丸等药用菌，常利用菌核分离得到菌种。分离方法是将菌核表面消毒后，用解剖刀切开，取中间组织1小块，接入PDA培养基上，20℃—25℃培养。

3、菌索分离 密环菌，假密环菌常用菌索来分离。方法是将菌索表面消毒后，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用无菌剪刀剪成小段。移接在PDA培养基上，20℃—25℃培养，有白色菌丝长出且无污染，即表明分离成功。

（二）孢子分离法

孢子分离法是利用菌类的成熟孢子能自动弹射的原理，在无菌操作条件下，使孢子在适宜的培养基上萌发长成菌丝体而获得菌种。

1、种菇的选择 孢子分离用的形态不同，孢子分离的方法也不同。

①整菇插种法：是将整只成熟度适当的种菇，经表面消毒后，插入孢子采集器内，放在适当的温度下，让其弹射孢子的方法。蘑菇、香菇、草菇等食用菌常用此法采集孢子。

②钩悬法：将新鲜的成熟度适当的耳片用无菌水冲洗后悬挂在无菌的三角瓶内或有孔钟罩内，在一定温度下让其弹射孢子。木耳、银耳常用此法采收孢子。

（三）、耳木（菇木）分离法

耳木（菇木）分离法是利用耳木或菇木中的菌丝体得到菌种的方法。

1、耳木的采集与选择 一般在该菌的生长季节里，选取生长的子实体大、肉质厚、成熟度适当、无杂菌感染的耳木或菇木进行分离。

2、分离方法 在所选耳棒长有子实体的部位，横断面锯下锯成1cm厚薄的木片，带入已经消毒的接种箱（或接种室）内。将上述木片浸入0.1%升汞溶液中30s—60s，用无菌水冲洗数次，以冲去残留的升汞液，放在无菌纱布上吸干水分，多面手用灭过菌的榔头，解剖刀切去树皮部分，把木片劈成小块，随后用镊子将小木块放入PDA培养基上，每管放一块，放适宜温度下培养。

（四）土中菌丝分离法

它是利用菌类地下的菌丝体来分离得到菌种的一种方法。主要用于腐殖质腐生菌的分离，用前述三种方法能分离得到菌种，一般不采用这一方法。但在野外采集时，菇类子实体已腐烂，而又十分需要该菌种时，就要用此法分离。具体操作如下：

①取菇体下与菇根相连的菌丝体，尽可能取较清洁的菌丝束。

②由于土壤中含有各种微生物，如细菌、放线菌、霉菌等，因此分离时要用无菌水反复冲洗菌丝束，把附着的泥土等杂物冲洗干净，把无菌棉花或纱布吸干水分。

③取菌丝束尖端部分，接入有细菌抑制剂的培养基中，25℃左右培养，无杂菌污染即分离成功。

④菌丝的鉴定。在土中获得的菌丝，其可靠性较小，必须经过出菇鉴定，才能确认是该菌的菌种。

二、菌种的培养

接种后的原种或栽培种全部拿出培养箱或培养室，根据不同食用菌菌丝发育最适温 度进行培养。培养2～3天后，菌丝开始生长时，要每天定期检查，如发现黄、绿、橘红、黑色杂菌时，要及时拣出清理。尤其是塑料袋菌种，检查工作到菌丝长满为止。培养室切忌阳光直射，但也不要完全黑暗；注意通风换气，室内保持清洁，空气相对湿度不要超过65%；同时菌种瓶、袋不要堆叠过高，瓶间要有空隙，以防温度过高造成菌丝衰老，生活力降低。特别是对加温的培养室要注意：一要保持室内温度的稳定，因在温差较大的情况(特别是母种培养)会形成冷凝水，而使菌丝倒伏变黄。有条件的话，可根据菇类的菌丝生长对温度的要求，按品种分开放在不同温度的培养室(箱)内培养。同时要注意经常调换原种、栽培种排放的位置以使同一批菌种菌丝生长一致。二要注意通风换气，以免室内二氧化碳浓度过高而影响菌丝生长。

第五节 菌种保藏

一个优良菌株被选育出来以后，必须保

持其优良性状，防止杂菌污染，才不致降低生产性能。因此保藏好菌种，对研究和生产食用菌都具有十分重要的意义。菌种保藏的方法有斜面低温、沙土管、液体石蜡封藏、冷冻真空及液氮超低温等。

一、斜面低温保藏法

这是最简单最普通的保藏方法，即将菌种在适宜的斜面培养基上培养成熟后，置于4—5'C的低温下保藏，以后每隔2～3个月转管一次。此法适用于除草菇外的所有食用菌菌种。草菇对低温忍耐力差，它的菌丝体在5 0C下即易死亡，因此草菇菌种应保藏在lo～13'(2的环境中。若需置于4～5℃的低温下保藏，应在草菇菌苔上灌注3～4mL的防冻剂。一般生产上，草菇多采用室内常温保藏。

低温保藏菌种的培养基一般用营养丰富的天然培养基，如马铃薯—葡萄糖—琼脂培养基等。为防止菌种在保藏过程中产生酸过多，在配制保藏用培养基时需添加少许缓冲盐，如磷酸二氢钾(KH2P04)或碳酸钙等。

斜面低温保藏菌种虽然简便，但保藏时间较短，需经常转管，故容易发生退化现象。为了弥补这一缺点，在生产上，最好把斜面低温保藏法与其他保藏法结合起来，以减少转管次数。母种在第一次转管时，尽量多移斜面试管，部分用第一次生产，取几管作矿油保藏(或冷冻干燥、液氮低温保藏)，其余则作为以后几批生产用的母种，暂存于4～6'C低温处，待低温保存的菌种用完后(或超过储存期后)，再从第一代矿油保存的菌种移出殖。这样做能使每批生产使用的菌种都保持在前几代的水平上，有利于菌种优良性状的保持(图3—1)。

二、液体石蜡保藏法

食用菌菌丝均可用石蜡保藏，一般可保存3年以上，但最好1—2年移接一次，即使不移接，室温下可保藏6～8个月。用此法保藏的菌种不必置于冰箱内，室内比冰箱内保藏效果更好。

液体石蜡又名矿油，是一种导泻剂，在医药商店有售。分装于三角瓶中加棉塞封口，高压蒸汽灭菌2～3次(每次30min)，然后经无菌检查合格后方可使用。由于高压蒸汽灭菌常有水蒸气渗入，需在4'C温箱或烘箱中烘烤8～10h，使水分蒸发。用无菌吸管将灭菌石蜡加入要保藏菌种斜面试管内，用量要高出斜面尖端约lcm。将棉塞齐口剪平，再用蜡密封管口。

使用矿油保藏菌种时，不必倒去矿油，用接种工具从斜面上取一小块菌丝先在无菌水

中洗涤，然后移接于斜面培养基上即可。原母种可重新封口继续保藏。

三、沙土保藏法

此法是将食用菌孢子保藏于干燥的无菌沙土中，保藏期为2一10年。具体方法如下：

1．取河沙过筛(60～80目筛子)，除去大沙粒，用10%的盐酸浸泡以除去有机物。盐

酸用量以淹没沙面为宜。浸泡2～4h后，倒去盐酸，用水洗几次，直到接近中性，烘干或晒

干。

2．沙与土比例以2 ：l～4 ：1为宜，沙过多影响菌种保藏质量，土过多时易结块，接

种后抽干困难。

3．把干沙、土按比例混合压装于安瓿管或小试管，装入量以0.5～lcm为宜，加棉塞，

高压蒸汽灭菌(压力在0．15MPa)灭菌3次，每次30min，干热灭菌(160℃，2h)。待无菌检

查合格后(取少许干沙土放入牛肉汤培养液中，无菌生长)方可使用。

4．用接种环将孢子接于沙土管中拌匀即可。或将孢于接于5mL无菌水的试管中，

充分播匀成孢于悬液，然后用lmL无菌吸管吸取孢子悬液加入沙土管中(每管加0.2mL)

即可。

5．将接种后的沙土管置于盛有干燥剂(生石灰、氯化钙或硅胶)的容器内，接上

0．5KW的真空泵抽气约8h，使沙土基本干燥。

6．经抽样检查，证明无杂菌生长，即可封口进行保藏。

四，真空冷冻干燥保藏法

此法是采用真空、干燥和低温三种手段来保藏菌种，因此菌种保藏期长达10～20年 后仍不降低其原有性能。

冷冻干燥保藏的基本方法是将需要保藏的孢子悬液装在特制的安瓿管中，然后骤然 冰冻，并立即抽成真空，使培养物以固体形态升华脱水，熔封后在低温或室温下保藏。

试验证明，用此法保藏蘑菇、香菇、侧耳和金针菇等食用菌的孢子和银耳的芽孢子3 年，全部存活，直至8年后仍有90%存活。可见用此法保藏食用菌孢子至少可存活8年。 但此法不能用来保藏不长孢子的菌类。

五、其他保藏方法

（一）液体超低温保藏法

试验证明，用一130～一196℃液体氮超低温冰箱能保藏所有食用茵菌种，包括一些不 能用冷冻干燥保藏的菌种，甚至“怕冷”的草菇以10%甘油和5%～10%二甲基砜做保护 剂，居然也能在超低温冰箱中保藏。由于超低温能使代谢水平降到最低限度，因此菌种基 本上不发生变异。

在启用液氮超低温保藏的菌种时，应先将安瓿管置于35～40℃的温水中，使管中的 冰块迅速溶解，然后再启安瓿管，取悬浮的菌丝块移植在培养基上活化培养。

（二）菌丝球生理盐水法

先将食用菌菌种用液体振荡培养3～7天，然后将形成的菌丝球吸入装有5mL无菌 生理盐水的试管中，每管约移人4—5个菌丝球。试管用无菌橡皮塞塞上，并用蜡封口，置 室温或4℃下保藏。一般可保藏1～2年。

（三）麦粒菌种保藏法

麦粒菌种保藏法是利用麦粒作培养料。用于保藏菌种的麦粒，含水量在25%左右， 这样的麦粒，在灭菌后种皮不破裂。制作方法；先将小麦浸水5h，滤去水后晾干麦粒表面 的水分，装入小试管，装入量为试管高的l/3；高压蒸汽灭菌(压力0.15MPa)灭30min；冷却后接人孢于液或菌丝悬浮液，摇匀后置于适温培养。当试管中的麦粒发满菌丝后，放人 装有氯化钙的干燥器内，进行抽气干燥，干燥后，将干燥器放于低温(20℃以下)处保藏。 此法保藏菌丝，经1～2午后，再接到培养基上，菌丝生长仍然良好。