可特异性地导致mRNA的降解，特异性地抑制mRNA的翻译，所用的mRNA可以来自体内或体外。

RNA沉默机制及其介导的植物抗病毒基因工程研究进展

摘要：RNA沉默是一种由双链RNA诱导同源RNA降解的现象，是植物的一种天然抗病毒机制。但是由于长

期的共进化过程，一些病毒会在siRNA沉默途径以及miRNA沉默途径中编码一些抑制蛋白来对抗这种机制，

使其作用受到抑制。文章对RNA沉默的发现、过程、抑制及其由RNA沉默介导的对RNA病毒、DNA病毒的抗

性、以及由转病毒基因介导的病毒抗性等几种植物抗病机制。同时，对研究中所存在的一些问题作了分析，并

RNA沉默被认为是一种基于核酸的有效的

免疫系统。事实上。一些细胞能够识别非必须的

入侵外源核酸．之后通过形成21-25个核苷酸长

度的核酸介导这些入侵的外源核酸的降解，虽然

这一过程的机制还不是很清楚。有关这一现象的

一个典型的例子是Napoli十多年前在转基因矮

牵牛中所做的实验。之后相类似的基因沉默现象

在真核生物中也有报道，这其中包括有真菌和线

虫．RNA沉默的分子基础也得到了一定的阐述⋯。

RNA沉默开始于dsRNA的合成，之后这一双链

RNA被一种称为Dicer的第三类RNA酶切割成

21～25个核苷酸长度的小RNA。这些小RNA分

子贯穿于整个RNA沉默的过程，在RNA沉默的

过程中起重要作用。它们直接诱导一多组分复合

物一RNA诱导沉默复合物(RISC)结合外源RNA．这些外源RNA具有同源性。RISC总是包含

一些Ago蛋白家族成员，像人类中的A902蛋白【引，

在RISC中表现出内切酶活性。RNA沉默的第一

种天然的功能被认为是抵抗病毒入侵。之后又发

现在植物RNA和DNA病毒的复制过程中有源

自于病毒的小RNA的积累f3]，这些小RNA被认

为引起病毒mRNA的切割，限制病毒的感染。因

为在RNA沉默过程中诸如Dicer酶和Ago蛋白

等一些基本蛋白存在于大部分的生物中，很自然

人们就提出了RNA沉默作为一种保守的病毒防

御机制在生物中普遍存在。

1 RNA沉默的发现

公认的第一次发现RNA沉默这一现象的是

由van der Krol，Napoli以及他们的合作者所做的

未能在转基因矮牵牛中过量表达查尔酮合成酶

(CHS)的试验。他们得出：转基因RNA不仅抑制

自身表达，也抑制内源基因的表达的结论，这一

现象被称为共抑制(CO—suppression)。

之后．研究者观察到沉默的GUS基因能够阻

止携带有GUS序列的马铃薯X病毒(PVX)

的积

累。这一发现直接导致了后来被称为转录后基因

沉默(PTGS)这样一种序列特异性抗病毒防御机

制的提出。通过对表现出RNA沉默弱化现象的

拟南芥不同突变种的鉴别，揭示了有关病毒诱导

的基因沉默作用途径的更多细节(4】。

到了1 999年由Hamilton署llBaulcombet5】证实具

有转基因沉默现象的植物内有小的dsRNA累积，

而dsRNA与转基因高度同源。真正具有开创性意

义的工作是由Fire和他的合作者四完成。他们发

现：只要给秀丽杆菌注入少剂量的dsRNA，虫体内

就能被诱导产生他们称之为RNA沉默的现象。

通过不同生物RNA沉默路径的阻断实验。

科学家发现：RNA沉默具有很强的保守性，表明

它在生物的发育、基因调节、抗病毒以及染色体

构建等方面作为一种古老的机制而发挥重要的

作用。

2 RNA沉默的过程

在植物中，控制病毒粒子的复制被认为是

RNA沉默众多作用中最主要的一种。尽管表达转

基因RNA可以引起RNA沉默．自然状态下的

RNA沉默更具适应性，通过识别“外来”分子而启

动这一过程。这种识别随后被转化为“效应”、“记

忆”以及“预警”信号而传递给整个植株。双链

RNA分子被认为是最适宜的RNA沉默启动者。

因为绝大多数的病毒都是RNA病毒．通过形成

双链RNA复制酶进行病毒复制。所以假定这些

分子为RNA沉默的引发者显得很有意思。然而，

情况要复杂得多．虽然大部分植物RNA病毒经

由双链而复制，但是这些RNA处于裸露状态的

概率却很小，因为复制复合体被病毒复制蛋白和

(或)衣壳蛋白所保护。病毒的复制通常发生在特

定的复制区域．同时dsRNA在病毒或者宿主

RNA解旋酶的作用下立即变得松散[7】。我们认为

病毒的mRNA。也许会被植物定义为“异种”

(aberrant)，它将会是一种重要的对象。也能够在

RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用下形成

双链RNA。这样就可以说明当植物感染单链

DNA病毒一双联病毒(Geminiviruses)后形成病毒

特异性的siRNA这一现象隅]。

拟南芥的染色体编码4种能将dsRNA切割

成siRNA分子的类Dicer酶【9]。在一个正常的病

毒感染的过程中．植物包含有大量的病毒来源的

siRNA分子。这些siRNA随后被用于两个方面：

一方面siRNA结构变得松散．其中的一条链组合

进入RNA诱导的RNA沉默复合物(RISC)，定位

和降解与siRNA同源的靶RNA；另一方面，植物

中的RdRP利用siRNA作为同源mRNA的引物

来合成dsRNA．之后dsRNA又被Dicer酶

加工成

次级siRNA。后一步导致了细胞内沉默信号的放

大。植物中，RNA沉默通道中所形成的siRNA能

够从mRNA目的位置的5’端和3’端合成，表明

传递性是双向的。而在线虫中，次级siRNA却只

能从mRNA目的位置的5’端合成[10]。这可能与

植物中siRNA的每一条链都比较稳定而在线虫

中只有负链稳定有关。哺乳动物中，沉默信号的

传递性据称是不存在的。内源性的RdRP同时也

被证实不是这一过程所必须的。在所有的真核生

物RNA沉默过程中，2Ints的siRNA都能被观察

到并被认为是起到局部RNA沉默的作用⋯】，这种长

度的siRNA引起的沉默信号传递是短距离的。在没有信号放大的情况下能传播10—15个细胞f12]。

但是，在植物中还能够产生一系列大小约为

24nts的siRNA⋯。这些较长的siRNA可能与沉

默信号的远距离传递有关。这一能力使得植物

RNA沉默通道中产生的siRNA能够先于病毒在

邻近的细胞之问传递。RISC也被认为是事先被编

码好的．配合siRNA．迅速识别和消灭人侵病毒。

3 RNA沉默的抑制

作为一种对抗机制．许多植物和动物病毒通

过编码抑制蛋白阻断宿主的RNA沉默进程，这

一阻断作用发生在siRNA沉默途径以及大部分

的miRNA沉默途径中的各个阶段[13，14】。抑制蛋白

在siRNA引导的RNA沉默的抑制过程中能够抑

制甚至是完全祛除siRNA的作用。抑制蛋白对

miRNA引起的拟南芥RNA沉默的作用是导致拟

南芥发育缺陷．这一缺陷是由Agol部分突变以

及改变其他一些基冈的表达效率所致，这些相关

基因主要在miRNA的合成以及植物体的新陈代

谢过程中起作用。通过对一些沉默抑制蛋白的研

究，对于它们的分子作用机理有了较深的了解，

而这其中理解最透彻的是番茄丛矮病毒科病毒

编码的P19蛋白。P19蛋白并没有影响由dsRNA

形成siRNA的过程，但形成同向二聚体与siRNA

结合在一起，阻止siRNA进入RISC[15,161。这样，

RNA沉默的效应物包括RISC就不能被激活。原

来认为P21蛋白不影响细胞自主性RNA沉默。

最近有研究指出。P19蛋白抑制RISC的活性与

细胞自主性RNA沉默是联系在一起的rl71。但是，

对于番茄从矮病毒属病毒的感染，这一作用可以

忽略掉．因为细胞自主性RNA沉默无法与快速

复制的兰花环斑病毒(CymRSV)相抗争；在编码

抑制蛋白基因突变的植物细胞质中，病毒粒子大

量聚集。但是，细胞自主性RNA沉默对于控制那

些复制较慢的诸如马铃薯Y病毒属的病毒

来说

却是极为重要的．因为带有HC—Pro基阑突变的

烟草蚀纹病毒在细胞质里不能聚集。甜菜黄化病

毒编码的P21抑制蛋白和芜菁花叶病毒编码的

P1/HC—Pro抑制蛋白可能具有和P19蛋白相类似

的作用机制。对其他一些沉默抑制蛋白的作用机

理也有一些假设．诸如兽棚病毒(一种寄生在果

蝇等昆虫体内的小RNA病毒)通过编码的B2蛋

白结合dsRNA和siRNA抑制siRNA的形成¨8】：

P38蛋白直接抑制DCLl(RNaseHI家族的Dicer

同源物)的活性c19]。

黄瓜花叶病毒(CMV)编码的2b蛋白是最早

鉴定出的可以抑制转录后基因沉默(PTGS)的两

种抑制蛋白之一。一直以来科学家认为2 b蛋白

对miRNA引起的RNA沉默很少甚至是不起作

用。最近对2 b抑制蛋白的作用机制的研究又有

了新的进展。通过诱导Agol等位基因部分突变。

科学家发现：CMV编码的2 b蛋白能够阻断

miRNA引起的RNA沉默过程。最终引起植物生

长的变异m211，其途径主要通过直接与Agol蛋白

酶结合，阻止其进入RISC，抑制其切割活性直接

削弱RNA沉默以对抗宿主的防御体系。

4 RNA沉默介导的植物抗病毒基

因工程

4．1 RNA介导的对RNA病毒的抗性

科学家发现。转基因表达病毒编码蛋白的含

量经常与植株所表现出来的病毒抗性不相关。一

些试验中表达的病毒相关蛋白含量极低甚至检

测不到，但植株仍表现出很高的病毒抗性．随后

通过表达非翻译的转基因提出了转基因产生的

RNA可以介导植物产生病毒抗性。Lindbo等五最

先把这一现象和先前的共抑现象联系起来．提出

转基因能够诱导出所有与转基因序列相一致的

RNA的观点。在转病毒基因这一过程中能够诱导

植株产生抗病性。这一RNA的特异性识别序列

主要是由转基因产生的siRNA所决定。因为在感

染病毒和类病毒的野生型植株中也发现了sir．

NA．不难得出RNA介导的病毒抗性是植物中天

然存在的一种防御机制的结论。科研人员通过构

建反向重复(IR)序列siRNA的前体dsRNA对这

一问题进行深入研究．发现反向重复序列的构建

能够显著提高转基因植物的抗性∞J。一般来说，

转病毒单链正义或者反义基因赋予植物的病毒

抗性只有20%左右．但是转入能够产生dsRNA

的IR序列的植物对病毒的抗性却高达90%圳。

很多试验都已证明转病毒正链RNA不能获得满

意抗病性。而构建IR转基因序列是一种获得高效抗病性转基因植物的重要途径。由Tougou等人

完成的工作使这种植物抗病性策略的有效

性得

到了佐证瞄】。大豆矮缩病毒(SbDV)是一种正义单

链RNA病毒．之前从未见过有关抗SbDV转基阂

大豆的报道，他们通过转入被GUS基因间隔的

SbDV外壳蛋白(coat protein)的反向重复序列(分

别来自于病毒的正义链和反义链)成功获得了抗

SbDV的转基因大豆。研究人员在70株潜在的转

基因植株中筛选出3株成功转入该目的基因的

植株。56个T1代植株中有38株含有CP基因，

通过蚜虫接种SbDV病毒发现8株对SbDV表现

出较强抗性，其中3株含有与SbDV．CP具有同源

性的siRNA不含有SbDV特异性的RNA。另外5

株两者兼有，因此siRNA的产生直接导致了转基

因植物中病毒序列特异性的RNA诱导的沉默复

合物(RNA．induced silencing complex，RISC)的出

现，且RISC的出现先于感病症状的出现。当病毒

感染植株时，在病毒编码的沉默抑制蛋白发挥作

用前。病毒RNA就已经被快速而有效地识别并

降解了。这一过程与病毒常规感染植株过程形成

了鲜明的对比：病毒常规感染过程中。RNA沉默

过程的滞后使病毒基因编码的沉默抑制蛋白可

以发挥作用对抗RNA沉默。

研究还发现。RNA介导的植物抗病性的一个

缺陷是当转基因序列和病毒基因序列的非同源

性高于10%的时候，转基因就很难赋予植物抗病

性[矧。为了获得广谱的病毒抗性，Bucher等四构

建了一种全新的IR序列，这一序列融合了来自番

茄斑萎病毒属4个不同病毒种的长150nts的核

苷酸序列。这一策略获得了比较好的效果，此举

说明通过附加更多的病毒相关序列扩充转基因

结构。能够使转基因植物获得更为广谱的抗性。

4．2 RNA介导的对DNA病毒的抗性

感染了RNA病毒的植物细胞会产生病毒特

异性的siRNA。这些siRNA被认为来自于病毒

RNA复制过程中形成的dsRNA断裂产物或者来

自病毒RNA的二级结构。很有意思的事情是，一

些植物DNA病毒，象花椰菜花叶病毒属和双联

病毒科中的一些种也是RNA沉默的对象[28,29J。在

某些情况下。这种作用机制能让植物从病毒感染

中恢复过来，表明RNA沉默是一种广泛存在的

植物天然抗病毒策略。

通过向植物转入DNA病毒的正义和反义链

RNA，科学家成功获得了抗番茄金色花叶病毒

(TGMV)、番茄黄曲叶病毒(TYLCV)以及番茄黄

叶卷曲撒丁岛病毒(TYLCSV)的株系。为进一步

提高转基因植物抗病性。Pooggin等i30通过在植物

中表达菜豆金色花叶病毒属黑鹰嘴豆黄花叶病

毒(VMYMV)基因组某区域的IR结构，获得了抗

病恢复系植株。Zrachya及其同事[3¨通过构建针

对CP基阕的IR序列获得了抗番茄黄曲叶病毒

的转基岗植物。同样的，Noris等[321和Ribeiro等[33】

通过转基因手段在植物中表达病毒相关的siR．

NA，分别获得了对番茄黄叶卷曲病毒(TYLCSV)

和番茄褪绿斑驳病毒(ToCMoV)抗性的植株。与

抗RNA病毒株形成鲜明对比的是对DNA病毒

产生完全免疫的转基闪植株尚未得到．这也说明

病毒mRNA是RNA沉默的主要对象。

4．3转外壳蛋白基因介导的病毒抗性

在植物中转入某一病毒外壳蛋白(coat pro．

tein)基因，可以使植物产生对相关病毒的抗性，

这一过程称为外壳蛋白介导的抗性(coat protein．

mediated resistance，CPMR)。CPMR的分子机制目

前尚未完全弄清楚，针对不同病毒的CPMR分子

作用机制很不相同阻】。最近研究发现，由转外壳

蛋白基因介导的抗性有可能不仅仅和外壳蛋白

有关．还和RNA介导的抗性有关——高水平或

者是广谱的植物病毒抗性是由外壳蛋白和RNA

干扰共同引起的。在植物中表达番茄斑萎病毒

(tomato spotted wilt virus．TSWV)的Ⅳ基因(nu—

cleocapsid gene)所引起的受体植株的抗性被认为

是由RNA沉默介导的[35J．但在试验植株中转基

因的转录水平很低。植物获得的抗性也仅局限于

针对TSWV供体株．对其它番茄斑萎病毒属成员

并无抗性。由Kertbundit等人完成的工作也提到

了转番木瓜环斑病毒CP基因赋予番木瓜对病毒

的抗性也是由RNA沉默所介导的m]．通过基因

枪法获得了8株表现病毒抗性的转基因植株，

Nothern blotting分析得知凹基因在7株中转录．

但其中只有2株获得表达蛋白。上述这些结果表

明转基因植株获得的病毒抗性不是由coat pro．

tein所引起而是由RNA沉默所介导的。对这一现

象的解释是：粒子枪轰击将外源基因整合到宿主

染色体上是一个相当复杂的过程．在整合位点上通常包含有多拷贝的转基因，这些转基因存在一

定程度的重排；重排导致的基因融合、反向重复

就有可能引起转录后基因沉默(PTGS)。Tougou

等∞J通过转大豆矮缩病毒(Soybean dwarf virus

SbDV)cP基因的正链RNA到大豆中获得了对这

一病毒的抗性．样株6产生的39株他中有29

株显示了SbDV抗性，且均可育，Nothern blotting

可检测到SbDV．CP的mRNA。接种病毒后，可检

测到SbDV特异性siRNA．未检测到其他SbDV

特异性RNA，说明转基因植株对SbDV的抗性也

是由RNA沉默引起的。

5 问题和展望

近几年对RNA沉默机制的研究取得了较大

的进展．对RNA沉默组成原件以及路径有了更

加深入的了解。但是，在这一过程当中还是存在

很多问题有待解决。比如说最近的研究发现人类

细胞中存在有大量的和siRNA以及miRNA相类

似的小RNA存在。他们的潜在功能是调节几乎

所有的人类基因的表达。那么在RNA沉默过程

当中到底牵涉有多少种的小RNA呢?这些小

RNA又是如何产生的?而他们具体的生物学功能

又是什么?他们又是如何调控RNA沉默路径的

呢?在这其中又包含有一个潜在的问题：因为这

些小RNA在5’端和3’端∞3都产生过修饰．目前

的测序手段不能保证对这些小RNA进行完整的

测定。但是下一代r圳测序手段应该能够揭示这些

小RNA的分子信息。

对RNA沉默介导的植物抗病性的研究仍在

继续深入，在研究过程中一些新的现象伴随着问

题出现在研究者的面前：如甲基化[幻】、转基因拷

贝数、转基因纯合抑或杂合态、RNA沉默的发生

位点以及环境因素等等如何对RNA沉默产生影

响?对这些问题的进一步研究将大大促进对这一

广泛存在的植物天然抗病毒机制的深入了解。

以RNA沉默作为理论基础的研究在植物抗

病毒的研究中表现出很高的应用潜力。这是因

为，同以往的复制酶基因以及衣壳蛋白基因介导

的植物病毒抗性相比较，它更为高效，特异性更

强。虽然现在该技术离真正实现商业化利用比较

遥远，RNA沉默的分子机制也还没有完全搞清

楚，而且病毒还编码各种RNA沉默抑制子来对

抗这一机制。但是，随着研究工作的深入，相信其

分子机制的神秘面纱终究会被揭示．而基于这一

理论基础的植物抗病毒基因丁程亦将蓬勃发展．

在植物抗病性研究和应用领域发挥重要作用。