binding-change ATP

结合变构机制

氧化磷酸化：ATP形成机制［细胞生物学］

2007-8-12 17:33　【大 中 小】【我要纠错】

氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）是指在活细胞中伴随着呼吸链的氧化作用所发生的能量转换和ATP的形成过程。

呼吸链含有三个氧化磷酸化偶联位点

电子传递与ATP合成偶联的假设

早在20世纪30年代， Vladimir Belitzer首先提出电子传递与ATP合成偶联的假设。他在体外测定肌组织制备物合成ATP与氧消耗比值时发现，呼吸链每传递一对电子至少可合成两个ATP.后来有人发现P/O比值（形成的ATP数与每个还原氧的比值）接近3，也就是说可合成三分子ATP。

氧化磷酸化偶联位点

根据对呼吸链中不同复合物间氧化还原电位的研究，发现复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ每传递一对电子，释放的自由能都足够合成一分子ATP，因此将复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ看成是呼吸链中电子传递与氧化磷酸化偶联的三个位点。

如果以FADH2作为电子供体，则只有两个ATP合成偶联位点。因为FADH2提供的电子是经复合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ传递的，而复合物Ⅱ不能作为ATP合成的偶联位点，所以只有两个偶联位点，这就意味着由FADH2作为电子供体时，只能合成两分子的ATP.

实验证明

上述ATP合成的数量和偶联位点得到实验的支持。如将分离的线粒体内膜小泡与抗霉素（antimycin）一起温育，由于抗霉素阻止电子通过细胞色素b-c1（复合物Ⅲ），NADH释放的电子只能传递到辅酶Q，其结果，每传递一对电子只合成一分子ATP.因此可以推论复合物Ⅰ是ATP合成的偶联位点。用同样的方法证明复合物Ⅲ和复合物Ⅳ也都是ATP合成与电子传递偶联位点。

偶联因子1（coupling factor 1）的发现及功能预测

发现： 在二十世纪七十年代初，Humberto-Fernandez Moran 用负染技术检查分离的线粒体时发现：线粒体内膜的基质一侧的表面附着一层球形颗粒，球形颗粒通过柄与内膜相连（图7-30）。几年后，Efraim Racker分离到内膜上的颗粒，称为偶联因子1，简称F1.

图7-30 ATP偶联因子电镜照片

牛心脏线粒体的负染电镜照片，可见球形颗粒通过小柄附着在线粒体内膜嵴上。

功能预测

如果按照常规的方式思考所发现颗粒的问题，似难理解线粒体内膜上需要ATP水解酶，如果将ATP的水解看成是ATP合成的相反过程，F1球形颗粒的功能就显而易见了：它含有ATP合成的功能位点，即ATPase既能催化ATP的水解，又能催化ATP的合成，到底行使何种功能，视反应条件而定。

实验证明

通过体外实验证明上述的推测是正确的，现在将该酶称为ATP合酶。

请设计一个实验证明ATPase既能催化ATP的水解，又能催化ATP的合成

线粒体ATP合酶的发现和功能预测及实验证实表明，在科学研究中，不能总是按常规思维去认识事物，反向理论也有很重要的作用。

ATP合酶功能的鉴定： 线粒体膜重建实验

为了证明F1具有ATP合酶的作用，人们试图进行线粒体膜的重建实验，主要是将线粒体内膜与其嵴上的F1颗粒分离出来，重新装配后研究F1的功能。

实验的结果确证从线粒体内膜中分离的F1颗粒具有偶联电子传递和ATP合成的功能。

ATP合酶（ATP synthase）的结构和功能

电镜下的结构

从电镜照片（图7-31）看， 线粒体内膜内侧的F1颗粒结构可分为两个基本部分：F1（头部，head section）、F0（基部，base section），在F1和F0之间有一个细细的柄部（stalk section）。

图7-31 ATP合酶的形态

（a） 电镜照片； （b）根据电镜照片绘制的模式图和各部分的大小。

组成

F1颗粒是一个多组分的结构，将它称为F0F1 ATP酶复合物， 或ATP合酶，在分离状态下具有ATP水解酶的活性，在结合状态下具有ATP合成酶的活性。除了线粒体中有ATP合酶外，植物叶绿体的类囊体和好氧细菌都有ATP合酶的同源物，线粒体ATP合酶有F0和F1两部分组成（图7-32）， 主要功能是进行ATP的合成。也有学者将它看成是线粒体内膜呼吸链的第五个复合物（complex Ⅴ）。

图7-32 ATP合酶的结构和组成

氧化磷酸化偶联机理：化学渗透假说

关于氧化磷酸化的偶联机理，先后提出过几种假说，如化学偶联假说（chemical coupling hypothesis）和构象偶联假说（conformational coupling hypothesis），这些假说由于证据不足得不到公认。

英国生物化学家P.Mitchell 于1961年提出了化学渗透偶联假说（chemiosmotic coupling hypothesis）解释氧化磷酸化的偶联机理。该学说认为：在电子传递过程中， 伴随着质子从线粒体内膜的里层向外层转移， 形成跨膜的氢离子梯度，这种势能驱动了氧化磷酸化反应（提供了动力）， 合成了ATP.这一学说具有大量的实验支持，得到公认并获得了1978年诺贝尔奖。化学渗透学说可以很好地说明线粒体内膜中电子传递、质子电化学梯度建立、ADP磷酸化的关系（图7-33）。

图7-33 线粒体在有氧呼吸中的主要作用

ATP合酶合成ATP的机理

结合变构模型（binding-change model）

ATP合酶合成ATP的分子机理的研究一直是研究的热点， 为多数人接受的ATP合酶合成ATP的模型是“结合变构模型”。该模型认为F1中的γ亚基作为C亚基旋转中心中固定的转动杆， 旋转时会引起αβ复合物构型的改变。有三种不同的构型，对ATP和ADP具有不同的结合能力： ①O型几乎不与ATP、ADP和Pi结合；②L型同ADP和Pi的结合较强；③T型与ADP和Pi的结合很紧，并能自动形成ATP，并能与ATP牢牢结合。当γ亚基旋转并将αβ复合物转变成O型则会释放ATP（图7-34）。

图7-34 结合变构模型

定子（stator）和转子（rotor）

Timothy等人提出了一个ATP合酶中能量转化过程的模型（图7-35），该模型认为由abα3β3δ组成了“定子（stator）”，cγε则形成“转子（rotor）”。当H+质子穿过a和c之间的通道时产生了力矩，从而推动了转子与定子间的相对转动，这样在F1中合成了ATP.

图7-35 F0 F1-ATP合酶作用机理图解

γ亚基旋转的离体培养证明

目前已经可以在光学显微镜下观察到F1中γ亚基的旋转运动（图7-36），但现在还没有直接的证据显示在F0中有某些亚基作旋转运动。

图7-36 F1和γ旋转的实验证明

实验中对F1进行人工改造， 使之带上组氨酸（每个亚基一个），由于组氨酸能够同覆盖有金属还原剂（Ni）的玻片结合， 因此可使F1固定到这种玻片上。通过人工的方法将γ结合上一条荧光标记的肌动蛋白纤维， 然后在供给ATP的情况下用荧光显微镜观察γ亚基的转动

The Nobel Prize in Chemistry 1997

　Paul D. Boyer and John E. Walker have shown how the enzyme ATP synthase makes ATP. ATP synthase is found in chloroplast and mitochondrial membranes and in the cytoplasmic membrane of bacteria. A difference in hydrogen ion concentration across the membrane drives the enzyme to synthesise ATP.
"The Binding Change Mechanism"
Using chemical methods Paul Boyer proposed that ATP synthase is like a cylinder with alternating alpha and beta subunits. An asymmetrical gamma subunit in the middle of the cylinder causes changes in the structure of the beta subunits when it rotates (100 r.p.s.). He termed these structures open (betaO), loose (betaL) and tight (betaT).
Four stages in ATP synthesis　

　A molecular machine is discovered
John Walker crystallised the enzyme to study its details. He established that Boyer's proposal for how ATP synthesis takes place, the "molecular machine", was correct.　

　
ATP synthase
The enzyme consists of an FO part bound in the membrane and a projecting F1 part. The F1 part is known in detail, while less is known about the FO part.
The FO part consists of three different protein molecules (subunits a, b and c). When hydrogen ions flow through the membrane via a disc of c subunits, the disc is compelled to rotate. The gamma subunit in the F1 part is fixed to the disc and therefore rotates with it. The alpha and beta subunits in the F1 part, however, cannot rotate because they are locked in a fixed position by the b subunit, which is anchored to subunit a in the membrane.
As the gamma subunit functions as an assymmetrical axle, the beta subunits are compelled to undergo the structural changes described in the figures