限制性长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphsm,简称RFLP），指不同个体制备的DNA，使用同一种限制性内切酶酶切，切得的片段长度各不相同的生物学特性。酶切片段的长度可以作为物理图谱或者连接图谱中的标记分子。这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。

通常DNA上存在大量的限制性内切酶酶切位点。因此，限制性内切酶能将很长的DNA分子酶解成许多长短不一的小片段，片段的数目和长度反映了DNA分子上限制性酶切位点的分布。特定的DNA/限制性内切酶组合所产生的片段是特异的，它能作为某一DNA（或含有该DNA的生物）的特有“指纹”，这种“指纹”在DNA分子水平上直接反映了生物的遗传多态性。