RT-PCR简介

原理

过程

影响因素

RT-PCR简介

反转录·聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）是将RNA的反转录（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。

原理

只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

过程

RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在反转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，在同时为反转录和PCR优化的条件下，反转录和PCR在一直观众顺次进行。

1、反转录酶的选择 1、Money 鼠白血病病毒反转录酶

有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37°。

2、AMV反转录酶

有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适温度为42°。

2、合成cDNA引物的选择

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。　RT-PCR引物的选择：

1. 随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。

2. Oligo dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA

和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。

3. 基因特异性引物 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。

影响因素

RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。

1、建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。

2、对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。

3、大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。