| 词条 | 沙立度胺 |
| 释义 | § 医药名词 沙立度胺，反应停，酞胺哌啶酮 沙利度胺 Thd § 性状 淡黄色结晶性粉末，无臭无味，微溶于水、乙醇、丙酮中，不溶于乙醚、氯仿。熔点269～274℃。 § 作用机制 免疫调节作用沙利度胺片 Thd的免疫调节作用很大程度上依实验条件不同而不同，结果有时相互矛盾。对淋巴细胞的作用包括降低CD4+细胞和刺激CD8+细胞，从而降低CD48比率。另外，Thd似乎诱导Th1应答向Th2应答转变。Mchugh等[1]比较了环孢素与Thd对T淋巴细胞的两种亚型Th1和Th2作用，发现Thd能够诱发并增强IL-4和IL-5的合成，抑制植物凝集素刺激的人外周血单核细胞合成干扰素γ（IFN-γ），降低TNF-α、IL-6和IL-10mRNA的水平，而对IL-12和IFN-γmRNA的水平无影响。对淋巴细胞增殖的影响：Fernndez等[2]认为，Thd发挥其免疫调节能力是通过激活T淋巴细胞产生IL-2和表达高亲和力的IL-2受体，促进淋巴细胞增殖来实现的。 抗炎作用 Thd的抗炎作用主要基于抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α），TNF-α是主要的致炎细胞因子。免疫学研究证实，单核细胞产生的TNF-α参与宿主免疫正常过程，但如果过量产生TNF-α，则可刺激机体产生一系列的炎症反应，例如TNF-α是导致许多细菌感染性疾病产生的中毒性休克的关键因素之一。Moreir等[3]给7～9周雌鼠静脉注射脂多糖100～350μg后，测定TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10，这些细胞因子水平明显升高，而在注射脂多糖前，给予Thd20mg.kg-1，TNF-α的合成减少93%，TNF-αmRNA的合成减少70%，IL-6水平降低50%，使用Thd后脂多糖的半数致死量也明显提高。Thd抑制TNF-α合成的作用依细胞类型和诱导剂的不同，结果也有差异。Thd抑制TNF-α合成的机制尚未完全清楚，近年有研究表明Thd通过抑制抑制性κB（IκB）激酶来抑制NF-κB的活性[4]，从而抑制TNF-α合成。Thd的抗炎作用还包括抑制环氧化酶（COX）。Noguchi等[5]研究认为，Thd有COX-1/2的抑制活性，可与阿司匹林类药媲美，其结构研究得出了可作为潜在的COX-1/2抑制剂、COX-1选择性及COX-2选择性抑制剂。 抗血管生成作用沙利度胺结构式 在正常情况下，血管生成是一种重要的和基本的生理活动，系指毛细血管从业已存在的血管周围生成的过程。它在正常或病理情况下均可发生，如器官形成、伤口愈合、肿瘤生长等。在血管生成过程中，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及血管内皮生长因子（VEGF）的作用最关键。血管生成抑制作用是近几年发现的，概念产生于20世纪90年代。血管生成抑制剂由于没有化疗药品的细胞毒性，毒性较小，成为近年来抗肿瘤研究的重大突破。 1994年D'Amato等[6]发现口服Thd能够显著抑制bFGF诱导的兔角膜血管生成，推测Thd致畸作用可能因为抑制了胎儿发育过程中的肢芽血管生成所致。Belo等[7]报道，Thd对海绵诱导的小鼠纤维血管生成的抑制率达40%。Verheul等[8]以Thd与舒林酸合用对bFGF和血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）诱导的兔角膜血管生成抑制率分别达65%和74%。Moreir等[9]发现Thd及其类似物CC-1609在体外可显著抑制内皮细胞的增殖，并伴核因子SP1（transcriptionfactor1）和NF-κB（nuclearfactor-κB）的低表达，推测Thd抗血管生成作用与其抑制SPl和NF-κB有关。Price等[10]检测到Thd的体内两种代谢产物5-OH-thalidomide和5'-OH-thalidomide，并在鼠动脉模型上证实了后者的抗血管生成活性，而前者无此作用。但在体外实验及人隐静脉模型中未发现5'-OH-thalidomide有抗血管生成活性。有人认为，Thd的抗血管生成作用有种属特异性[11]，单剂Thd对家兔有血管生成抑制作用，而对小鼠没此作用。Belo等[7]的实验证实了，Thd对小鼠血管生成的抑制作用，但未发现Thd对同种系小鼠所荷Ehrlich瘤有抑制作用，因而推测Thd的抗血管生成并非种属特异性，而是组织特异性。Myoung等[12]以200mg/kg/d剂量Thd，治疗口腔上皮细胞癌裸鼠，发现肿瘤组织VEGFmRNA，VEGF蛋白和CD31表达水平均明显低于对照组，但口腔上皮细胞癌大小在实验组与对照组间无差别。复旦大学沈梅等报道，Thd能明显抑制人卵巢细胞癌裸鼠皮下移植瘤生长和血管生成，实验组和对照组肿瘤体积分别为649.72士274.39和1086.15士262.25mm3（p<0.01）。 调节细胞黏附 整合素（integrin）是由白细胞合成和分泌的一种跨膜蛋白，由a和β两个亚基组成，能通过调节细胞与细胞外基质相互作用来调节细胞粘附，其中以整合素αvβ3最为重要。胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子（vascularcelladhensionmolecule，VCAM-1）等都是整合素αvβ3的配体。体外实验[13]发现Thd能明显下调T细胞表面的黏附分子ICAM-1和LFA-1表达，抑制T淋巴细胞黏附分子（celladhensionmolecule，CEM）和脐静脉内皮细胞间的黏附。Stephens等[14]认为，Thd正是通过整合素αvβ3（血管生成正性调控因子）来抑制血管生成的，它与αvβ3基因及其某些正调控基因启动子序列GC盒中，富含GC区域结合而抑制αvβ3的转录，而不同种属和器官组织血管调控通路对αvβ3的依赖性决定了其对thalidomide的敏感性，这就解释了不同研究中Thd抗血管生成的效能并不一致的原因。 § 药理作用 沙利度胺 为一种镇静剂，对于各型麻风反应如发热、结节红斑、神经痛、关节痛、淋巴结肿大等，有一定疗效，对结核样型的麻风反应疗效稍差。对麻风本病无治疗作用，可与抗麻风药同用以减少反应。 1免疫调节作用Moreaira等在鼠静注脂多糖30mg后，测定TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10细胞因子，这些细胞因子的水平明显升高，而在注射脂多糖前，给予沙利度胺20mg/kg，TNF-α的合成可以减少93%，TNF-αmRNA的合成可以减少70%，IL-6的水平降低50%，使用沙利度胺后脂多糖的半数致死量也明显提高。沙利度胺抑制TNF-α合成的作用依细胞类型和诱导剂的不同，结果也有差异。有人用环孢素A与沙利度胺进行比较，测定两者对T淋巴细胞的两种亚型TH1和TH2的作用，发现沙利度胺能够诱发并增强IL-4和IL-5的合成，抑制植物凝集素刺激人外周血单核细胞合成IFN-γ，降低TNF-α、IL-6和IL-10mRAN的水平，而对IL-12和IFN-γmRAN水平无影响。此外，沙利度胺还可以激活T淋巴细胞产生IL-2，促进T淋巴细胞增殖。 2抑制肿瘤细胞生长作用骨髓瘤患者的骨髓中，可见血管增生，产生骨髓心血管化，近几年的研究发现，沙利度胺能够抑制兔角膜中碱性成纤维细胞产生因子的表达，进而减少兔角膜血管的生成，具有搞血管新生作用，因此，它有抗肿瘤和抗增殖的作用。此外，沙利度胺还可以通过其代谢产物抑制肿瘤细胞与ConA覆盖的聚乙烯微粒的附着，且这种抑制肿瘤细胞与底物附着能力对细胞并无毒性作用。 3对大鼠急性肝功能衰竭的保护作用肿瘤坏死因子（TNF-α）是由单核巨噬细胞所分泌的一种细胞因子，肝病患者TNF-α的表达水平升高，与肝坏死的程度密切有关，刘树人等用急性肝功能衰竭的大鼠模型，灌胃给予沙利度胺，观察其对大鼠死亡率、细胞因子、转氨酶、肝组织病理学和单个核细胞肿瘤坏死因子mRNA表达的影响，结果大鼠的病死率沙利度胺组（40%）明显比模型组（72.0%）低，其中TNF-α、转氨酶的水平也明显低于模型组，对其他细胞因子也有抑制作用。 4对炎症的作用沙利度胺对鼠关节炎模型（类风湿性关节炎）可减轻其关节炎症状，呈剂量依赖性，这种作用与降低TNF-α和血管内皮生长的水平有关。实验证明沙利度胺可使急性败血症鼠模型的TNF-α的含量降低而减轻其炎症反应并使动物的存活率由19%提高到53%。 § 临床应用研究 沙利度胺 1治疗麻风性结节红斑以色列皮肤病学沙利度胺作为镇静药给麻风性结节红斑病人使用，症状迅速改善。以后许多例麻风性结节红斑病人使用反应均获得很好的治疗效果，最近美国和英国批准本品用于治疗严重性或复发性麻风性结节病的皮肤症状。 2治疗皮肤性血管红斑狼疮国外多位学者报道沙利度胺对传统治疗无效的狼疮皮肤病变，可以获得满意的疗效。另一组研究结果称，沙利度胺用于对糖皮质激素治疗无效的皮肤性红斑狼疮者，结果在90%（18/20）完成研究的病人中出现完全缓解，另2例出现部分缓解，沙利度胺有替代激素的作用。 3治疗重症肝炎用沙利度胺治疗11例重症肝炎，并且对外周血中单个核细胞分离，体外培养，观察沙利度胺对单个核细胞TNF-α和其他细胞因子的影响，结果表明沙利度胺可以抑制单个核细胞TNF-α和其他细胞因子的产生，这些因子共同参与肝细胞的损害，其水平与肝损害的程度密切相关。结果显示，沙利度胺通过抑制上述有害因子的产生，而在治疗重症肝炎中有积极的意义。 4治疗复发性口疮病复发性口疮是最常见的口腔黏膜病，以往治疗方法极少有满意的根治效果，姜军松等报道了采用双盲法研究用反应停、己酮可可碱治疗复发性口疮患者，结果完全缓解，对照组仅有6.0%完全缓解，各研究组的治疗结果以反应停联合己酮可可碱组疗效最佳。国外还有许多人报道用反应停治疗复发性口腔、生殖器溃疡获得了良好效果。 5治疗风湿病国外学者报道，用反应停治疗7例多种抗炎药和免疫抑制无效的类风湿性病患者，结果多数在数周内缓解，剂量在400～600mg/d，所有病人的血沉和类风湿因子滴度都正常化或明显下降，其中1例的类风湿结节在12周时消失。有人用反应停和甲氨蝶呤联合治疗7例难治性类风湿病人，5例坚持治疗者中，4例在3～9个月关节压痛改善和关节肿胀减轻。 6治疗肿瘤复发性骨髓瘤是一种难治性顽症，此病传统化疗5年存活率较低（29.0%）。国外有人用沙利度胺治疗84例顽固性多发性骨髓瘤，治疗评估以血清骨髓瘤蛋白和尿中琼斯蛋白的比基线降低值为依据，结果有效率32.0%。目前用沙利度胺治疗骨髓的研究越来越多，均获得了较好的效果，这主要是由于其抗血管生成的作用所致。沙利度胺在杀伤肿瘤细胞时，绝不像放、化疗那样同时杀伤正常的细胞，这是最大的特点和优点。 7其他研究沙利度胺除了上述的临床治疗作用外，还有人用其治疗HIV感染、坏疽性脓皮病、结节病、皮肤扁平苔藓、难治性溃疡性结肠炎等，均获得较好的效果，但病例数较少，仍需扩大研究范围，进一步确定疗效。 § 不良反应 骨结构 沙利度胺除了致畸作用外，在研究中观察到的常见不良反应有：轻、中度便秘、疲劳、嗜睡、各种周围神经病变、直立性低血压，部分病人可发生红疹、水肿、甲状腺功能不足和中性白细胞减少。其中，致畸作用是其最大的危害，因此应慎重选用沙利度胺，对孕妇应禁用，对育龄孕妇最好不用，非用不可时，用药前应检查是否怀孕，使用中要绝对避免怀孕，对病人要做好有关沙利度胺安全性的宣传和指导工作，做好沙利度胺的不良反应监测工作。既要绝对保证用药安全，又要使病人消除顾虑放心地使用沙利度胺，做到安全高效使用沙利度胺。 沙利度胺的研究展示了它美好前景，它在多种疑难重症治疗中起着无与伦比的作用，相信在今后的研究，将会使它的治疗效果更加确切、机制更加清楚，会给更多的无望患者带来希望。如果通过改变其结构，克服其严重的致畸作用，提高其疗效，它将会发挥更大的作用。随着临床应用的改变及其研究的进展，沙利度胺会重新得到临床的认可。 § 注意 （1）本品有强烈致畸作用，妊娠绝对禁忌。非麻风病患者不应使用此药。 （2）副作用有口干、头昏、倦怠、恶心、腹痛、面部浮肿等。 （3）近年发现本品有免疫抑制作用，可用于骨髓移植。 § 用法 口服：每日100～200mg，分4次服。对严重反应，可增至300～400mg（反应得到控制即逐渐减量）。对长期反应，需要较长期服药，每日或隔日服25～50mg。 § 制剂 片剂：每片25mg。 § 抑制乳腺癌细胞增殖实验 沙立度胺 【摘要】背景与目的：观察沙立度胺对体外乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的抑制作用，以及对细胞凋亡和细胞周期的影响。材料与方法：经不同浓度(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的沙立度胺处理MCF-7和MDA-MB-231细胞不同时间(24h、48h、72h)后，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞存活和生长情况，分析量效关系、时效关系。采用流式细胞仪检测沙立度胺对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果：在10～200μg/ml浓度范围，沙立度胺对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖均有抑制作用(P<0.01)。在药物作用48h后，对各组细胞的抑制率均达到高峰，尤以100μg/ml浓度组抑制率最高。沙立度胺作用后的乳腺癌细胞在流式细胞分析图上见细胞凋亡峰(亚G1峰)，100μg/ml沙立度胺作用48h后，MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡率分别为9.66％和11.18％，与对照组凋之率比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论：沙立度胺对MCF-7和MDA-MB-231细胞的体外增殖具有明确抑制作用，并可诱导细胞凋亡。 沙立度胺具有抗肿瘤作用，已用于胶质细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌的Ⅱ期临床研究。我们通过体外实验观察沙立度胺对乳腺癌细胞增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达是否具有抑制作用，为临床应用提供实验资料。材1料与方法 1.1 细胞株与材料 人乳腺癌细胞由河北医科大学附属第四医院科研中心保存。沙立度胺(thalidomide)为Sigma公司产品，批号093K461。溶于二甲基亚砜(DMSO)配制成50mg/ml浓度储存备用。四甲基偶氮唑蓝(MTT)为华美生物工程公司产品，流式细胞仪(FACS420)为美国BD公司产品。 1.2 细胞培养 将MDA-MB-231、MCF-7细胞置于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中(pH7.2～7.4)，在37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养。待细胞贴壁生长铺满瓶壁时，以0.25％胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。 1.3 MTT法检测细胞增殖反应 将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100μl含1×104个细胞，置于CO2培养箱中，37℃培养24h，待细胞附壁后小心吸出各孔内培养液，设置溶剂对照组及4个含不同沙立度胺浓度(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的DMEM培养液组，控制溶剂终浓度<0.5％(V/V)，并将上述各组又细分为不同时间组(24h、48h、72h)以观察时效关系。每组均设3个复孔，置于CO2培养箱中，37℃继续培养，培养结束前4h，各培养孔加入MTT(5mg/ml)10μl，4h后，弃上清，每孔加入10％DMSO100μl，震荡10min后，用全自动酶标仪检测各孔吸光度值(OD570)，上述实验重复3次。用下式计算抑制率(cytotoxicindex,CI)： CI(％)=(对照组OD值－实验组OD值)/对照组OD值× 100％ 抑制率正值表示对细胞有杀伤作用，负值表示对细胞有促增殖作用。 1.4 流式细胞技术检测细胞凋亡 设置溶剂对照组及实验组(沙立度胺100μg/ml)培养48h，制成单细胞悬液，去上清并固定，调整细胞浓度为1×106/ml，取1ml细胞悬液，加入胃蛋白酶2ml，温育消化后离心弃上清液；加入1mlEB染液一步插入法进行DNA染色，用500目铜网过滤后上机测定。采用EB染色法分别测定3组细胞中的DNA含量变化及细胞凋亡情况。在DNA含量直方图上观察Sub-G1峰(凋亡细胞峰)是否出现。按下式计算凋亡指数(apoptoticindex，APOI)： APOI=(凋亡细胞数/所测细胞总数)×100％ 1.5 统计学方法 数据以－±s表示，用SPSS10.0软件对数据进行统计学处理。实验组与对照组的组间比较用t检验，各浓度组的组间比较用方差分析，以α=0.05为检验水准。 2 结 果 2.1 沙立度胺对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖的影响 结果见表1、2。沙立度胺各浓度组对MCF-7和MDA-MB-231细胞均有明显的抑制作用，同一浓度组作用24h、48h、72h的3个时间点中，当≥100μg/ml时以48h抑制率最高。不同浓度组处理MCF-7细胞48h，以100μg/ml组抑制率最高。 2.2 沙立度胺对乳腺癌细胞凋亡以及细胞周期的影响 流式细胞仪分析见图1和表3、表4。100μg/ml沙立度胺作用48h的MCF-7和MDA-MB-231细胞DNA直方图上的G1期峰前均显现亚G1期(细胞凋亡峰)。100μg/ml沙立度胺作用细胞48h，无论在MCF-7细胞实验组还是在MDA-MB-231细胞实验组，其凋亡率均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。100μg/ml沙立度胺处理MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞48h后，G0/G1期细胞均增多，S期和G2/M期细胞比例均下降，多数细胞阻滞在G0/G1期。 3 讨 论 沙立度胺化学名称是N-(2,6-二氧3-哌啶基)-邻苯二甲酰亚胺或2-(2,6-二氧-3-哌啶基)1H-异吲哚-1,3-(2H)-二酮[1]。近几年因其具有抗肿瘤作用应用于临床抗肿瘤治疗，但其抗瘤谱、最佳有效剂量、给药方式以及最佳的联合治疗方案，均有待进一步研究，作用机制亦不甚明了。为此，我们从基础实验角度观察了沙立度胺对乳腺癌细胞的影响，并初步探讨了部分作用机制。 我们采用MTT法来观察沙立度胺对乳腺癌细胞增殖的影响，预实验结果表明，沙立度胺的药理效应与剂量在一定范围内存在剂量-效应关系，但是超过此范围(200μg/ml)，继续增加浓度而效应不再继续增强。我们用MTT做进一步分析所测得的各组抑制率数值发现，沙立度胺的半数细胞增殖抑制浓度(inhibitoryconcentrationgiving50％inhibition,IC50)接近50μg/ml，远大于20μg/ml，而按照IC50<20μg/ml时，方能判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用的标准[2]，既然不能判定沙立度胺对乳腺癌细胞有杀伤作用，那么它是通过哪些机制来抑制乳腺癌细胞增殖的呢？ 已有报道沙立度胺可以诱导骨髓瘤细胞凋亡，并可使细胞增殖阻滞于G1期[3－4]。于是我们采用了流式细胞术来检测沙立度胺是否有诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。细胞发生凋亡时，DNA断裂产生小分子量DNA(单、寡聚核小体)溢出胞外，细胞内总DNA量降低，于正常G0/G1细胞群前出现一个DNA低染细胞群，称“A0细胞群”或“亚G1细胞群”，即凋亡细胞群。实验结果显示，经沙立度胺作用后，乳腺癌细胞在DNA直方图上的G1期峰前显现细胞凋亡峰亚G1期。100μg/ml沙立度胺处理细胞，MCF-7实验组细胞凋亡率显著高于对照组，MDA-MB-231实验组细胞凋亡率，亦高于对照组，其结果提示诱导凋亡是沙立度胺抑制乳腺癌细胞增殖的机制之一。流式细胞仪分析显示沙立度胺使G0/G1期细胞增多，G1期又称DNA复制前期，可以产生rRNA、mRNA以及tRNA核蛋白体，为进入S期(DNA合成期)做准备。这表明沙立度胺可以通过阻滞DNA合成进而抑制乳腺癌细胞增殖。 § 致心电图心肌缺血改变实验 本实验结果显示沙立度胺在一定浓度范围内可以抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖，而且该抑制作用并不受细胞雌孕激素受体(ER、PR)状态的影响(MCF-7细胞ER、PR阳性而MDA-MB-231细胞ER、PR阴性)，这对于ER和PR阴性，或内分泌治疗效果差的乳腺癌患者，无疑是一个有吸引力的治疗手段。目前沙立度胺由商业研究机构用于乳腺癌临床Ⅱ期，可望和传统的细胞毒药物相结合，成为现有乳腺癌治疗手段的良好补充。 病人，男，30岁。2年半来（2000年12月份开始）常于劳累后出现头晕乏力，活动后心慌，未介意，3个月后无明显诱因出现全身浮肿，在某驻军医院检查心脏彩超示全心扩大，少量心包积液，二，三尖瓣少量反流，肝脾大，未能明确诊断介绍来我院会诊。在我院化验血常规：WBC41×109/L，Hb87g/L，BPC112×109/L，蛋白电泳有M带，尿本周蛋白阳性，IgG219g/L，血浆蛋白电泳γ球蛋白37.1%。骨髓象（首次骨穿2001年2月7日）：增生活跃，红细胞呈缗钱状，浆细胞异常增生占23%，其中幼浆占135%，外周血浆细胞占5%。确诊为多发性骨髓瘤。给予M2方案化疗6个疗程，症状体征消失，心脏恢复正常大小，实验室检查血常规、肝功、肾功均正常，尿本周蛋白阴性，免疫球蛋白IgG，IgA，IgD正常。骨髓象：浆细胞在5%以下，且均为成熟浆细胞，达完全缓解。2002年6月骨穿示浆细胞5%，骨髓活检示浆细胞占50%，复发。给予VAD方案化疗3个疗程，末次化疗结束时间2003-01-20停止，复查骨髓象示成熟浆细胞占2%，无幼稚浆细胞，再次缓解。于2003年2月开始用干扰素，300万U，皮下注射，1次/隔日；沙立度胺（反应停）300mg，2次/d。于2003年4月17日心电图示Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ1，Ⅴ3，Ⅴ5导联T波倒置，将沙立度胺减量至400mg/d后心电图无好转，沙立度胺用3个月后停用，改用维甲酸治疗1个月后心电图恢复正常。查体：无贫血貌，胸骨无压痛，双肺听诊未闻及干湿啰音，心界不大，心率68次/min，律齐，心音正常。腹平软，肝脾未触及。血常规、肝功、肾功均正常，尿本周蛋白阴性，免疫球蛋白IgG，IgA，IgD正常，骨髓象示成熟浆细胞占2%，无幼稚浆细胞。 讨论 沙立度胺是一种谷氨酸衍生物，有抗炎、免疫调节作用。因其有止吐、镇静作用曾广泛地应用于早孕反应，后由于该药的严重致畸胎作用，又在60年代初被禁用。近年来，由于其具有抗焦虑、催眠、止吐和止痛及抗血管生成作用，在多种严重疾病和症状的治疗中被再次广泛应用。沙立度胺治疗多发性骨髓瘤的主要机制是抑制肿瘤新生血管生成，其在心脏方面的副作用只有心动过缓[1]。国内外尚无沙立度胺可致心肌缺血改变（心电图T波倒置）的报道。导致心电图T波倒置的机制可能是它抑制心肌新生血管生成，从而导致心肌缺血—T波倒置。虽然患者骨髓瘤为轻链型，易致心肌损害，但患者病后做心电图一直无异常，可除外之。治疗方面，用改善心肌缺血的药物无效，停用沙立度胺为唯一选择。 § 免疫正调控作用实验 沙利度胺对骨髓瘤的作用 多发性骨髓瘤（MM）的治疗目前仍是世界性难题，临床上缺乏理想的治疗方法。自从Singhal等［1］1999年将沙利度胺用于MM的治疗取得显著疗效以来，已进行的多个临床试验结果显示，沙利度胺对MM有肯定的作用，约32%-64%的患者可获得疗效，而且副作用小、使用方便、费用小，是临床上安全、有效、经济的治疗MM的理想药物。但是，沙利度胺治疗MM的机制目前还不清楚，人们公认的沙利度胺的抗肿瘤机制即血管生成抑制作用与临床的疗效间缺乏相关性，在沙利度胺治疗有效者未观察到骨髓微血管密度下降。越来越多的证据表明，免疫调节作用可能是沙利度胺治疗多发性骨髓瘤的主要机理。目前，有关沙利度胺治疗MM免疫调节机理的报道甚少，我们研究不同浓度的沙利度胺对正常人外周血单个核细胞(PBMNC)增殖、淋巴细胞亚群、细胞因子分泌及其杀伤活性的影响，以期进一步阐明沙利度胺治疗MM的机理，为其临床应用提供理论依据。 材料和方法 临床资料 正常人10例来源于健康志愿者，男6例，女4例，年龄24-56岁，中位数年龄38岁，经体格及相关实验室检查确定为健康人。 细胞株、试剂及仪器 人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226购于中国医学科学院基础医学研究所，沙利度胺(商品名：反应停)购于Sigma公司，RPMI1640培养液（10.5g）购于Gibco公司，胎牛血清（100ml）购于杭州四季青生物科技有限公司，淋巴细胞分离液购于上海华精生物科技有限公司，MTT粉购于华美生物工程公司，PHA购于上海伊华医学科技有限公司，淋巴细胞亚群检测试剂盒购于美国BectonDickinson公司，人IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10ELISA试剂盒购于北京莱博生物科技有限公司。 沙利度胺的配制 称取20mg沙利度胺溶于1mlDMSO中，配成沙利度胺贮备液（20mg/ml），临用前用培养液稀释至所需浓度。 沙利度胺对PBMNC增殖影响的MTT检测 无菌抽取健康人外周血20ml，肝素抗凝，用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞，小心吸取各管中间白膜层于另一离心管中，加入氯化胺作用8分钟，用含10%胎牛血清的RPMI1640洗3遍，调整细胞浓度为3×105/ml，除调零孔外，每孔需加入PHA1μl(1mg/ml)，使各孔PHA终浓度为5μg/ml，将细胞加入96孔圆底培养板中，每孔加入3×104个细胞。设5个沙利度胺浓度组：0.1、1.25、5、20和100μg/ml，每种浓度设3个复孔，同时设阴性对照组、调零孔组及DMSO对照组。沙利度胺稀释为250μg/ml加入各不同浓度组，每孔终体积为200μl，37℃、5%CO2下培养72小时后，按常规操作步骤进行。然后上酶联免疫检测仪，在490nm波长下测各孔吸光度OD值。 沙利度胺对淋巴细胞亚群影响的流式细胞术检测 外周血单个核细胞的分离方法同上，调整细胞浓度为1×106/ml，每瓶加入2ml。设6个沙利度胺浓度组：0、0.1、1.25、5、20和100μg/ml,并设二甲亚砜组为对照，同时每瓶各加PHA2μl（12.5mg/ml），每瓶终体积为5ml，各瓶PHA终浓度为5μg/ml。细胞在含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素及链霉素的RPMI1640培养液中于37℃、5%CO2下培养72小时，然后收获各培养瓶中的细胞，用0.01mol/LPBS洗1遍，调整细胞浓度为5×106/ml，检测按FACS检测淋巴细胞亚群试剂盒操作说明进行。 沙利度胺对PBMNC细胞因子分泌影响的ELISA检测 用ELISA方法检测培养上清液中IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10的水平，操作按试剂盒说明书进行。 沙利度胺对PBMNC杀伤活性影响的MTT检测 以外周血单个核细胞为效应细胞，调整细胞浓度分别为106/ml、2×106/ml及4×106/ml；以对数生长期的RPMI8226细胞为靶细胞，调整细胞浓度为105/ml；共设2组，分别为阴性对照组及沙利度胺组（5μg/ml），同时设立效应细胞对照、靶细胞对照、加沙利度胺的靶细胞对照（5μg/ml）和RPMI1640调零孔。除靶细胞对照和调零孔外，其余各孔加入PHA1μl（1mg/ml），在96孔培养板中每孔加入效应细胞、靶细胞各50μl，每孔设3个复孔，终体积为200μl，共设3个效靶比，分别为10∶1、20∶1、40∶1，每组10个样本。37℃、5%CO2下培养72小时，操作按常规步骤进行。按下列公式计算杀伤百分比。 杀伤百分比=［1-（ODE+T-ODE）÷ODT］×100% 式中，ODE+T为效应细胞+靶细胞OD值;ODE为效应细胞OD值;ODT为靶细胞OD值。 统计学分析 以SPSS10.0统计软件进行统计分析，组间比较采用成组设计的两样本均数比较的t检验。以P<0.05为检验水准。 |
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