| 词条 | 酵母双杂交 |
| 释义 | 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 i 。典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域： DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。 基本思想酵母双杂交由Fields在1989年提出. 他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究. GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain,AD).DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合. 而AD则是通过与转录机构（transcriptionmachinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录. DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录. Fields建立了一个双杂交系统，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录. 他们利用Snf1与Snf4的相互作用， 将Snf1与BD融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上. 其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是他的一个结合蛋白. 研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY：171 菌株，该菌株含有LacZ 报告基因，并已去除相应转录因子基因. 该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录. 一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵（bait),X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物（prey），能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因，通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用. 基本原理二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体： a 含DNA -binding domain的载体； b 含DNA-activating domain的载体。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd）； 另一个蛋白的基因融合到转录激活结构域（如GAL4-ad， VP16）。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列（nuclear-localization sequence）， 而GAL4-ad没有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4（1-147）; LexA (E coli转录抑制因子）的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4（768-881）和疱疹病毒VP16的编码序列等。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因（reporter gene）的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点： 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达（如lacZ）， 从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用， 具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强， 后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统的发展随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域（DNA binding domain,DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。 文库筛选将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒；将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母；再将文库质粒转化到酵母中。 通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白，从酵母中分离质粒然后转化E. coli ，从大肠杆菌中提取质粒并测序 ，在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性。 结构组成酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要结构域， 如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v， p21cip1蛋白与增殖细胞核抗原(proliferating-cell nuclear antigen， PCNA) 的结合序列vi等。 此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。 特点与优点酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点： ⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵ 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、p16与CDK4iv等之间的相互作用。 局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的应用， 但仍存在一些局限性。⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。 许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展，。例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少"假阳性"的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白间的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因（常用lacZ和HIS3）有以下优势vii：⑴ 用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因， 可明显减少假阳性。⑵ 通过营养型筛选增强了筛选能力， 尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。 哺乳动物双杂交系统Ⅷ也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。在此系统中，一种感兴趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体（CAT）共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。假如两个融合蛋白相互作用则cat报道基因表达水平明显增高。用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用， 得到了酵母双杂交系统相同的结果。且较酵母双杂交系统更为快速，在转染48h内得到结果。并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段 常见问题的解决与改进酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，则也可单独激活报告基因的表达。因此，为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同，这可减少大量的假阳性。另外，报告基因通常整合到染色体上，可以使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析： （1）这种相互作用是否会在细胞内自然发生，即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。 （2）某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。 （3）一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体（motif）如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。十年来，酵母双杂交技术一直在消除假阳性方面不断改进，并且已取得较好的效果〔2，3〕。 在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来〔4〕。造成假阴性的原因主要有两 方面：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题，但也应予以重视。 转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一，特别是对低丰度cDNA库进行筛选时，必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化，相比之下共转化省时省力。更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时，共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中，通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。 目前很多机构建立了大量的cDNA文库和基因组文库，但这些文库大多无法直接用于双杂交系统的筛选。而文库的质量对于转化和筛选又非常关键。因此，大量构建适用于酵母双杂交的文库非常必要。现已出现一种采用体内重组技术来达到这个目的的方法〔5〕。 酵母双杂交的改进版本反式转录因子抑制（RTA）系统 与经典的Y2H相反，诱饵-猎物的互作将抑制转录因子激活报告基因。诱饵蛋白X与Gal4的DBD融合后具有转录因子的激活活性，另一个蛋白Y与一种转录阻碍物（Tup1p）的抑制结构域（RD）融合。如果两者可以相互作用，报告基因的转录就会被抑制[60]。RTA系统已被用于研究哺乳动物basic helix-loop-helix proteins MyoD和E12、protooncogenic transcription factor c-Myc与the putative tumor suppressor protein Bin1蛋白间的相互作用。同时，该系统还被用于筛选与各种转录激活因子的相互作用，如单纯性疱疹病毒（HSV-1）调控蛋白VP16 [60]，c-Myc及雄性激素受体。 SOS和RAS募集系统 (SRS and RRS)是Ras信号通路转录的旁路（are bypassing the transcriptional readout by using the Ras signalling pathway），在酵母细胞和哺乳动物中是相似的。Ras被定位在质膜上，可通过酵母中的Cdc25或哺乳动物中的Son of sevenless (SOS)脒基交换因子进行GDP-GTP的转换。Ras被激活后会引发下游信号转导途径。此处描述的Y2H系统使用Cdc25-2温度敏感型酵母菌株，因为Cdc25-2没有活性，不能激活Ras信号转导途径，导致此菌株在高温（36 ℃）下不能生长。通过Y2H系统中选择性激活Ras，可以使其温度敏感表型消失。 SCINEX-P系统（胞外蛋白间的互作筛选）由Urech等于2003年发布，使我们可以分析ER内的氧化环境中的蛋白互作。该系统利用酵母未折叠蛋白反应（UPR）的信号途径。ER中错误折叠蛋白的积累会诱导酵母ER I类跨膜蛋白（Ire1p）形成二聚体，后者诱导Hac1p转录，其产物可激活分子伴侣的转录。在SCINEX-P系统中，目的蛋白与缺少位于腔内的N末端寡聚化结构域的Ire1p突变蛋白（ΔIre1p）融合。两种杂合蛋白的互作会引起Ire1p蛋白二聚体的重构，从而激活UPR下游信号转导过程。为了检测蛋白互作，Hac1p UPR元件被引入报告基因的启动子上。此Y2H系统被成功地用于分析蛋白质二硫键异构酶ERp57与钙联蛋白间（这两个蛋白都在ER中折叠）、抗原与抗体间的互作。 分裂化泛素系统 由Johnsson和Varshavsky于1994年设计，可用于测定细胞质基质蛋白间的互作检测；后来又被扩展为膜蛋白间的互作筛选。泛素是一类小蛋白，对于细胞中错误折叠的蛋白是十分重要的。蛋白通过与一个多聚泛素蛋白链共价结合被标记为蛋白酶体的降解对象。该链将被泛素特异性蛋白酶（USP）首先从蛋白上降解。分裂泛素化Y2H技术基于泛素可分裂为两个独立的片段。已有的研究显示泛素可分裂为N端（Nub）及C端（Cub），并且这个片段间有亲和性，可能自发形成与原泛素类似的蛋白。通过在Nub（NubG, NubA）的点突变（I13G or I13A ）可使Nub和Cub的自发组装无法进行。 在这两种突变体中，只有两部分由于NubG/A和Cub互作而被拉到足够接近的距离时，才能发生有效地结合。重构的分裂化泛素可被USPs识别，然后切掉与Cub C端融合的报告蛋白。最初的系统使用二氢叶酸还原酶作为报告基因，后者产物可通过SDS-PAGE检测。然而，由于需要使用免疫共沉淀和电泳分离，阳性克隆的鉴定十分不便。 膜反式转录激活因子分裂泛素(MbY2H)系统使用人工转录因子（LexA-VP16）作为与泛素相连可被水解的报告蛋白，可分析ER膜蛋白间的相互作用。一旦泛素被重组，LexA-VP16就被释放到核中并激活报告基因的转录（如HIS3，LacZ）。这种转录激活方式放大了蛋白的互作反应，对瞬时互作的检更敏感、更方便。此系统已被成功用于检测不同种类膜蛋白间的互作反应。分裂泛素系统已被广泛应用于cDNA文库筛选和大规模矩阵法中。 近期，改进后适用于胞质蛋白互作筛选的MbY2H系统已被发布。在此改进方案中，诱饵载体上包括Cub和转录因子，并且由于融合了ER膜蛋白Ost4p，使此融合蛋白锚定在ER膜上。 酵母双杂交技术发展前景在后基因组时代更具意义且更能发挥酵母双杂交技术的领域是研究生命活动中的网络调节〔18〕。第一个具有开拓性的工作是Bartel利用酵母双杂交技术建立了一个T7-噬菌体的网络调节图（linkage-map）〔19〕。Fromont-Racine等对筛选到的阳性克隆进行鉴定测序，并将它们分为5类，然后对其中的四类（非编码序列除外）通过15轮的筛选与分析，绘制出一张综合了酵母蛋白相互作用的全局性信息图〔20〕。这是以往的实验所难以获得的。 为适应功能基因网络调控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大学的EST项目研究成果基础上，采用了与传统建库方式完全不同的细胞内同源重组方法，以高通量规模构建了一种阵列模式的酵母双杂交cDNA文库。它主要有以下特点： （1）来源于多种组织器官和细胞系，因此含有几乎所有基因的cDNA； （2）所含各种cDNA的丰度趋于平衡； （3）含有较长的插入序列，但不是全长cDNA序列。 这样既避免了5’非编码区可能存在的终止密码阻碍融合蛋白的翻译，又保证了表达出的蛋白构象接近于天然。这种建库方法不仅减少了工作量，而且在双杂交中新发现的相互作用蛋白种类也明显增多〔21〕。 最后，有必要指出的是，酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。 |
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