DNA解旋酶（DNA helicase），通常为流体蛋白环，通过ATP水解产生的能量由解旋酶装载器装载到DNA单链上（单链穿过环中央），有3‘--5’或5‘--3’方向极性，该极性就是它结合的单链的极性。它像DNA聚合酶一样具有延伸性。

与解旋酶装载器结合，装载到单链DNA上之前，DNA解旋酶是没有活性的，只有解旋酶装载器将它装载到单链DNA上，解旋酶装载器自动离开之后，DNA解旋酶的活性才被激活。直到双链全部解开，运动到单链末端时，它才从单链上离开。

注意DNA解旋酶结合的是DNA单链而不是双链，至于它结合的单链，是由起始子蛋白作用到被称为复制器的DNA区段使该区段发生双链解旋才产生的。

DNA解旋酶作用于DNA双链的氢键上。