Ⅰ.基本概念

Ⅱ.反应步骤

Ⅲ.DNA的变性与复性(a.变性 b.复性)

Ⅰ.基本概念

PCR是聚合酶链反应的英文缩写。该反应是根据DNA变性，复性原理设计的。反应系统中包括含目的基因的微量样品，耐热的DNA聚合酶，4种dNTP（脱氧核苷酸）以及两种过量的引物。引物一般长20-30bp（可以用人工合成）

Ⅱ.反应步骤

该反应分三步进行：

a.DNA模板（目的基因和引物）高温度变性（95°C） 使之解链。

b.降温复性（40°C-60°C），使目的基因与引物杂交。

c.在70°C-75°C的温度下，DNA聚合酶进行酶促聚合反应，使目的基因DNA序列在3’位置上逐渐延伸。新合成的引物延伸链又可以作为下一步反应的模板，如此反复循环进行，按照2^n的指数扩增，短时间内可获得大量的DNA目的基因。

Ⅲ.DNA的变性与复性

DNA的PCR扩增是根据DNA变性，复性原理设计的，变性与复性的简介如下。

a.变性

DNA变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。

变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变： 1）溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。? 2）溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。 3）增色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。

b.复性

DNA的复性指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为" 退火"(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。以下简要说明之。

变性DNA溶液在比Tm低25℃的温度下维持一段长时间,其吸光率会逐渐降低。将此DNA再加热,其变性曲线特征可以基本恢复到第一次变性曲线的图形。这表明复性是相当理想的。一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件,越远离此温度,复性速度就越慢。在很低的温度(如4℃以下)下,分子的热运动显著减弱互补链结合的机会自然大大减少。从热运动的角度考虑,维持在Tm以下较高温度,更有利于复性。复性时温度下降必须是一缓慢过程,若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下),复性几乎是及不可能的,核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。