| 词条 | 蛋白质顺序分析 |
| 释义 | 蛋白质顺序分析是蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序。测定蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序，又称蛋白质的一级结构分析。一般需要以下的技术和步骤：蛋白质的纯化，测定分子量，分析辅基或配基，氨基酸定量组成分析，末端分析，拆开二硫键，肽的裂解、纯化及顺序测定，寻找接头肽以连接成完整的肽链，再经过二硫键定位，最后列出完整蛋白质的顺序。 protein sequencing蛋白质的纯化待测定顺序的蛋白质样品，需要较高的纯度。须通过多种方法鉴定,如末端分析、电泳、等电聚焦、氨基酸定量组成分析等都证明是均一的蛋白质，杂质含量在5％以下，才适于做顺序分析。 测定分子量一般用凝胶过滤法，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法。从两种数据，还可知道样品蛋白质是否有亚基结构。 辅基和配基分析简单蛋白质不含辅基和配基。但结合蛋白质含糖、核酸、脂质或其他有机化合物，这些物质会干扰顺序分析，需采用特殊方法除去。 氨基酸定量组成分析用氨基酸自动分析仪能准确测定蛋白质样品中各种氨基酸的含量，特别是某些氨基酸，如甲硫氨酸、色氨酸、精氨酸和赖氨酸等的含量对设计顺序测定方案很重要。 末端分析多肽链的一端为NH2，称为N端，另一端为COOH，称为C端。N端测定用FDNB（2,4-二硝基氟苯），DNS-Cl (5-二甲氨基萘磺酰氯)，PITC(异硫氰酸苯酯)和DABITC(4-N，N-对二甲基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯) 等化学试剂测定。也可用氨肽酶法。C 端用肼解法或羧肽酶法测定。有的蛋白质的N末端被其他化学基团，如乙酰基,或环化谷氨酸所封闭，就不能用上述方法测定。通过末端分析也能了解蛋白质由几条肽链组成和样品的纯度。 拆开二硫键肽链中的半胱氨酸残基，常以二硫键的方式与肽链中的其他部位半胱氨酸残基连接，测定顺序时须先拆开二硫键，使肽链呈松散的直链，便于降解和裂解。拆开方法是用巯基试剂还原羧甲基化，或用过甲酸氧化等。 肽的裂解和纯化先将蛋白质裂解成较大的肽段，以减少纯化和顺序测定的工作量。在一般蛋白质分子中，甲硫氨酸、色氨酸和精氨酸等含量较少，可用专一性高的试剂或酶针对这类氨基酸的肽键裂解,如用溴化氰,氢溴酸和胰蛋白酶等，能得到预期的结果。肽的纯化，一般用离子交换层析,凝胶过滤,电泳和纸层析等方法。70年代以来采用高效液相层析仪，其分辨率高,速度快,是纯化肽的最好工具。 肽的顺序测定①埃德曼（Edman）降解法。用化学试剂──异硫氰酸苯酯,能依次从N端逐个把氨基酸残基降解下来。每一步反应得到一个氨基酸衍生物。经多次重复的反应就得到更多的降解产物，分别鉴定后，即可列出肽链的氨基酸顺序。根据这个原理设计的自动顺序仪，一昼夜连续运转，可测出10多个顺序。但由于化学反应率的限制，不可能无限制地降解到底，因为即使在最好的条件下，每步反应率到98％，一般只能测到50步左右，这时留下的可供反应的N端愈来愈少，杂质愈来愈多,难以继续测定。所以通常需先把肽链裂解成肽段后再测其顺序。②酶法测顺序。用氨肽酶能从N端依次降解,用羧肽酶能从C端依次降解。酶解释放氨基酸是个动力学过程,需在不同时间取样定量测定，根据释放的过程列出顺序，由于酶解过程难以控制，此法得到的数据，一般仅为几个氨基酸顺序。 接头肽在完成许多肽段的顺序测定后,需要寻找接头肽以把各肽段连接起来而完成蛋白质的全部顺序。其连接法如图所示。用一个字母表示一个氨基酸残基： 第1种切法 ABCDEFG HIKLMNOP QRSTVWXYZ 第2种切法 FGHIK OPQRS 完整的肽链 ABCDEFGHIKLMNOPQRSTVWXYZ 二硫键定位用专一性低的蛋白水解酶，如胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等水解完整的蛋白质成为小的肽段，经分离纯化，找寻含二硫键的肽段。亚硝基铁氰化钠是二硫键的特殊显色剂。测定这些肽段的氨基酸组成和顺序，即可确定肽链内部二硫键的位置，得到完整的蛋白质的氨基酸顺序。 其他方法上面介绍的经典的蛋白质顺序测定法，是非常繁琐而工作量浩大的工作。50年代初测定含51个氨基酸残基的胰岛素花了8年时间,现在用自动化仪器和先进检测工具,只需花一周时间。1978年发表的β-半乳糖苷酶，含1021个氨基酸残基，可以说是经典法测定的顶峰。目前新的快速方法是从核酸(DNA)顺序推测蛋白质顺序,已经广泛采用，因在短期内可测数千个核苷酸顺序,从DNA的三联密码能准确推测出蛋白质的氨基酸顺序。这一方法近年来已经有取代上述经典方法的趋势，但是尽管如此，某些环节还须蛋白质顺序测定的经典法配合。 研究历史历史上第一个被确定氨基酸序列的肽（蛋白质）——胰岛素（insulin）。 1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素的一级结构，1958年获得Nobel化学奖。 1958年，Moore 和 Stein在Sanger 和Edman测序法基础上设计出氨基酸全自动分析仪，获1972年Nobel化学奖。 历史上第一个被确定氨基酸序列的酶（1960年）——核酸酶（ribonuclease, 124 AA）。 |
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