以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

概述

定义

原理

cDNA文库构建的注意事项(保证获得数量足够的高质量的起始RNA 反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键 层析柱cDNA分级很关键)

制备用于克隆cDNA的mRNA(1,mRNA的制备 2,mRNA的来源 3,mRNA完整性的检测 4,mRNA在细胞中的丰度)

Total RNA的提取(1.试剂配制 2.动物组织total RNA的提取 3.植物组织total RNA的提取 4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO))

mRNA的分离(1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 2.磁珠法分离mRNA)

cDNA双链合成(1. Superscipt II—RT合成第一链: 2. cDNA第二链的合成 3. 双链cDNA末端补平 4 EcoR I adaptor 加接 5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切 6.胶回收cDNA)

cDNA第一链的合成

cDNA第二链的合成(1,自身引导合成法 2,置换合成法)

双链cDNA分子的克隆

cDNA文库的筛选和鉴定(1 核酸杂交 2 特异性免疫学检测 3 cDNA克隆的同胞检测 4 cDNA克隆的确证)

cDNA文库组标准流程:载体制备(1．pBlueScriptII的提取 2．pBlueScriptII的双酶切消化 3．载体去磷酸化 4．载体效率检测)

鸟枪法(Shot gun):

物理化学方法

从蛋白质入手分离编码此蛋白的基因

基因的化学合成

PCR技术在目的基因制备中的应用(目的基因的直接克隆 cDNA的克隆)

概述

cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。

高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。

cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

定义

(cDNA Library)某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为E.coli.）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。

原理

经典cDNA文库构建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。

cDNA文库构建的注意事项

构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面：

保证获得数量足够的高质量的起始RNA

构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。

反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键

这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。

层析柱cDNA分级很关键

这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。

四、噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的基因cDNA长的有10kb以上，短的只有500bp或更短。一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果，不同长度cDNA的连接效率就不一样。有的专家的经验是，根据分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。

制备用于克隆cDNA的mRNA

1,mRNA的制备

动物细胞mRNA的制备

植物细胞mRNA的制备

2,mRNA的来源

选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等方法提高mRNA的含量

3,mRNA完整性的检测

1)mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统"。

无细胞提取物的制备：

用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.

常见的体外无细胞翻译系统:

兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白.

缺 点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA 。

麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23 ;将S23分装,保存于-20°C冰箱中.

利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA。

优 点：适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.

缺 点：不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止.

哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译

*SDS-PAGE analysis of proteins translated by cell-free translation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation products of total mRNA from mammalian cells

2) mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力

3)mRNA分子的大小

哺乳动物mRNA长度为500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.

4) 总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力

利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA

*Lane 1: -HindIII-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA;

Lane 3: the second chain of cDNA; Lane 4: -HindIII

4,mRNA在细胞中的丰度

1) 高丰度mRNA

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA .

2) 低丰度mRNA

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下.

5,mRNA的富集方法

典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝.

mRNA的丰度与文库克隆子数的关系

ln(1-P)

N= ln(1-1/n)

N: 所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例

1) 按大小对mRNA进行分级分离

* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低.

* 蔗糖梯度离心:加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.

2) cDNA的分级分离

* mRNA通过反转录形成cDNA,在插入到克隆载体前,通过琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的cDNA分子分离开来.

* 优 点:

a)避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解

b)增加了获得全长cDNA克隆的概率

c)获得更准确的分级分离效果(分子量)

3)多聚核糖体免疫学纯化法

* 使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱(A蛋白-Sepharose柱)上,随后用EDTA将多聚核糖体解离下来,并通过Oligo(dT)层析分离mRNA, 利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍. 目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝.

Total RNA的提取

1.试剂配制

准备工作：

1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方：

DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

0.78M柠檬酸纳：PH=4~5

三水合柠檬酸纳 22.94g

加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

10%肌氨酸钠：

肌氨酸钠 10g

加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

变性裂解液：

0.78M柠檬酸钠 8.25ml

10%肌氨酸钠 12.375ml

异硫氰酸胍 118.05g

加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用

临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）

2M 醋酸钠 PH=4.5

NaAc·3H2O 13.6g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

▲3M醋酸钠 PH=5

NaAc·3H2O 20.4g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

4M LiCL:

LiCL 24.164g

加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用

0.5M EDTA PH=8.0

EDTA 18.61g

用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用

10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):

MOPS 41.86g

NaAC·3H2O 4.10g

0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml

用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。

1x MOPS:

10x MOPS 30ml

加DEPC水270ml，用时现配。

4x RNA Loading buffer:

10x MOPS 400ul

甘油（高压过） 200UL

溴酚兰 10ul

甲醛(37%) 72ul

去离子甲酰氨 310ul

EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul

ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul

在4℃ 可保持3个月

10x PBS

pH=7.4

NaCl 80g

KCl 2g

Na2HPO4 14.4g

KH2PO4 2.4g

定容至 1000ml

变性电泳胶：

称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。

变性电泳缓冲液：

在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml

2.动物组织total RNA的提取

1． 根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。

2． 将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。

3． 根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。

4． 根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

5． 冰浴10分钟。

6． 4°C，12000g离心20分钟。

7． 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。

8． 加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀30分钟以上。

9． 4°C，12000g离心20分钟。

10． 根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。

11． 加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

12． 4°C，12000g离心20分钟。

13． 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀至少30分钟。

14． 4°C，12000g离心20分钟。

15． 弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C，12000g离心10分钟。

16． 弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。

17． 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80°C冰箱中保存。

表 1

Mg# of tissue　500　800　1000

变性裂解液(ml)　5　8　10

2M NaOAC pH 4 (ml)　0.5　0.8　1

水饱和酚 (mL)　5　8　10

氯仿 (mL)　1　1.6　2

异丙醇(mL)　4　6　8

变性裂解液 (mL)　0.5　0.8　1

异丙醇(mL)　0.5　0.8　1

75% 乙醇(mL)　1　1　1

DEPC-treated H20 (mL)　0.5　0.8　1

3.植物组织total RNA的提取

1. 先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。

2. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。

3. 加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。

4. 加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。

5. 冰浴10min。4℃，12000g离心10min

6. 小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。

7. 4℃，12000g离心20min。

8. 去上清，取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。

9. 4℃，13000rpm离心15min。

10. 用0.4ml DEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。

11. 4℃，13000rpm离心10min。

12. 取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。

13. 4℃，13000rpm离心15min。

14. 弃上清，用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。

15. 弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。

16. 用40－60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。

17. 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。

4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)

1． 查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。

2． 将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。

3．室温温育10分钟 。

4． 据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。

5． 4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。

6． 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20ºC沉淀1小时以上。

7． 4ºC,12000g离心10分钟。

8． 去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。

9． 4ºC，7500g离心5分钟。

10． 去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。

11． 取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80ºC冰箱中保存。

表2

组织量　TRIzol Reagent　氯仿　异丙醇　75%乙醇

50~100mg　1ml　0.2ml　1ml　1ml

mRNA的分离

1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法

准备工作：

1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。

2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。

3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。

试验步骤：

表3：加入试剂量据此表

Total RNA　RNase-free Water to:　Buffer OBB
(ul)　Oligotex
Suspension (ul)　Prep size

<=0.25mg　250ul　250ul　15　Mini

0.25-0.5mg　500ul　500ul　30　Midi

0.5-0.75mg　500ul　500ul　45　Midi

0.75-1.00mg　500ul　500ul　55　Midi

1. Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water 补足到500ul

2. 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension， 轻弹1.5ml离心管彻底混匀

3. 置于70℃水浴中3min

4. 取出置于室温（20℃－30℃）10min

5. 13000rpm室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。

6. 用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，离心1min

7. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ul OW2，RT， 13000rpm，离心1min

8. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml管中，取出25ulOER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。

9. 取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。

10. 测OD,并电泳定量。

2.磁珠法分离mRNA

1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.

2. 65&ordm;C加热10分钟。

3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul 20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10 分钟左右。

4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.

5. 将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。

6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。

7. 将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10 分钟。

8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。

9. 用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.

10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。

11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。

12.将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。

13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。

14.加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20&ordm;C沉淀过夜。

15.4&ordm;C，13000g离心60 分钟。去上清，加入500ul 70%乙醇混匀。

16.4&ordm;C，7500g离心10 分钟。

17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。

18.重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱

注意事项：

1．所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行

2．如果total RNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。

3．mRNA的电泳图是smear。

cDNA双链合成

1. Superscipt II—RT合成第一链:

1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入

xul mRNA(大约500ng)

1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)

11-x ul RNase-free water

（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）

2. 混匀后,70℃反应10分钟;

3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;

4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:

4ul 5×first strand buffer

2ul 0.1M DTT

1ul 10mM dNTP(自己配制)

5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;

6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;

7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.

2. cDNA第二链的合成

1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):

20ul 10×DNA Polymerase I buffer

6ul 10mM dNTP(自己配制)

xul dd H2O

1ul RNase H(2U/ul)

10ul DNA Polymerase I(10U/ul)

总体系为200ul;

2. 混匀后,16℃反应2.5小时;

3. 70℃灭活10分钟;

4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;

5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。

注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。

3. 双链cDNA末端补平

1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):

6ul 10mM dNTP

2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)

2ul BSA(10mg/ml)

2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;

3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;

4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;

5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;

6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;

7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;

8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.

注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。

PCR纯化试剂盒操作流程：

1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。

2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。

3．加入spin column中，13000rpm离心1min。

4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。

5．13000rpm，再离心1min。

6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。

7．13000rpm离心2min。

8．加入30ul buffer EB，静置10min。

9．13000rpm离心2min。

10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

4 EcoR I adaptor 加接

1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;

2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:

1.2ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)

3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;

5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切

1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;

2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:

1ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

6ul dd H2O

1ul T4 PNK(10U/ul)

3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;

4. 稍微离心使反应物集中至管底;

5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:

4ul Xho 10×Buffer

2ul BSA

5ul ddH2O

8ul Xho I (10U/ul)

6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;

7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。

6.胶回收cDNA

1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶

2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。

3．电泳50V；1hr

4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。

5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）

6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII

7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮

8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）

9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬

10． 离心并去上清（同操作8）

11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清

12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清

13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。

14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。

15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。

注意事项：

1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。

2．胶回收时电压要稳定。

cDNA第一链的合成

oligo(dT)引导的DNA合成法:

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.

缺 陷:

因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.

随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :

根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.

cDNA第二链的合成

1,自身引导合成法

单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.

缺 点:

在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.

自身引导法合成双链cDNA

2,置换合成法

原 理:

以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链.

优点:a)合成cDNA的效率高

b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化

c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA

3,引物-衔接头法

双链cDNA分子的克隆

将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠杆菌寄主细胞增殖.

1,同聚物加尾法

利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个片段连接成重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞.

同聚物加尾法克隆双链cDNA

2,接头-衔接头法

3,mRNA-cDNA克隆法

方 法:

在mRNA反转录合成cDNA第一链后,将dA残基加到mRNA:cDNA杂交体上,然后与带dT尾的克隆载体连接,转化受体细胞,在宿主细胞内,mRNA被降解并代之以DNA.

缺 点:

克隆的效率低(为双链cDNA克隆的1/10)

4,Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA

cDNA文库的筛选和鉴定

1 核酸杂交

是最常用,最可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子.

1)同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.

2)部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.

3)总cDNA探针:

通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.

cDNA扣除探针:

从第一种mRNA制备cDNA探 针, 连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交;

回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的第一种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.

* 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆.

5) 合成寡核苷酸探针

2 特异性免疫学检测

在cDNA表达文库中,目的基因的表达产 物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测

3 cDNA克隆的同胞检测

将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆.

4 cDNA克隆的确证

cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.

第四节 目的基因的分离

外源基因:

插入到载体内的那个特定的片段基因.

目的基因:

那些已被或者准备要分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA片段.

cDNA文库组标准流程:载体制备

1．pBlueScriptII的提取

1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上，37℃培养过夜。

2．第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10ml AMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜。

3．第三天取200&micro;l小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养6 hr左右，使OD值达到0.6-0.8。

4．将菌液移入250ml离心管中， 4℃，3000rpm，离心15min。取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。（注意离心前需配平）

5．加入10ml溶液Ⅰ（50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH8．0），加入RNase至终浓度100&micro;g/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置10min。

6．按NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鲜配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，静置3-5min。

注： 静置时间勿超过5min，提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。

7．加入15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴15-30min。

8．4℃，5000rpm，离心15min。

9．取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。

10．每管加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10min。

11. 20℃，12000g，离心20min回收质粒沉淀。

12．弃上清，用70%的乙醇洗2次。

13．弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。

14．用3ml TE（pH8.0）溶解沉淀，移入1.5ml Eppendorf离心管中。

15．电泳检查DNA质量并定量。（必要的话，可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。）

2．pBlueScriptII的双酶切消化

1．以如下体系进行EcoRI酶切：

pBSK(+) X &micro;l（6&micro;g）

ddH2O 174-X &micro;l

10×Buffer E 20 &micro;l

混匀，加入限制性内切酶：

EcoRI （10U/ &micro;l） 6 &micro;l

总体积为200 &micro;l。

2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3．37℃，水浴1hr。

4．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。4℃，13000rpm，离心15min。

5．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。

6．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。

7. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

8．加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。

9．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

10．自然风干沉淀，至无乙醇味，加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。

11．加入以下试剂进行XhoI酶切：

ddH2O 74 &micro;l

10×Buffer D 20 &micro;l

混匀，加入限制性内切酶XhoI：

XhoI （10U/ &micro;l） 6 &micro;l

总体积为200 &micro;l。

12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下

13.37℃，水浴1.5hr。

14．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。

15．4℃，13000rpm，离心15min。

16．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。

17．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。

18. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

19．加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。

20．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

21．自然风干沉淀至无乙醇味，加入40ulddH2O充分溶解沉淀，得到双酶切载体。

3．载体去磷酸化

1．在40ul双酶切载体中加入以下试剂：

6ul 10×buffer

6ul CIAP（0.01U/ul）

8ul ddH2O

总体积60ul。

2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3.37℃，水浴1hr。

4．70℃，15min，灭活酶。

5．电泳分离，胶回收双酶切载体，定量。

4．载体效率检测

1．按以下所示作4个连接反应：

　DNA　连接酶　

1　pBlueScriptII/E/X /CIAP　 -　检测酶切效率

2　pBlueScriptII/E/X /CIAP　 +　检测脱磷效率，载体自连效率

3　商品Vector加标准Insert　 +　对照

4　自制Vector加标准Insert　 +　检测载体效率

14℃连接过夜。

2． 各取1ul连接产物作电转化（具体流程见电转化）

3．计算克隆数，计算载体相对脱磷效率及连接效率。

鸟枪法(Shot gun):

又叫霰弹法,其特点是绕过直接分离基因这一关.由于目的基因在整个基因组中太少太小,在相当程度上靠"运气".

原 理:

基因组DNA

物理(剪切力,超声波等) 或生化方法(限制性内切酶)切割

长度与一般基因大小相当的DNA片段的混合物

随机地重组入适当的载体

转 化

大肠杆菌中扩增

适当的方法筛选

要求有简便的筛选方法:

利用特定基因缺陷型(如营养缺陷型等)的受体细胞,或特定的寡核苷酸DNA 片段探针以特定基因产物的抗体,可通过双表型的筛选或用分子杂交技术,免疫筛选技术检出目的基因.

示例:面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取

EcoRI 载体

酵母DNA 片段基因 重组DNA

转化

"吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型"大肠杆菌

基本培养基

筛选,分离菌株

目的基因

物理化学方法

基因工程初始阶段所用的方法,目前已不用.利用核酸双螺旋之间存在着碱基G C,A T配对特性,分离目的基因.

例如:海胆rDNA分子内其G C含量可以达63%(其稳定性高,溶解温度高),通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA,最后经氯化铯平衡梯度离心,得到相对分子量为1.9X107Dal的高纯rDNA.

从基因文库中分离目的基因

从蛋白质入手分离编码此蛋白的基因

如果手中有足够量可产生抗体的来源于真核细胞的蛋白质,可以通过双抗体免疫法分离出此蛋白的基因.

基本原理:

核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体,而具有不同长度的新生肽链在核糖体上不断延伸;

将从细胞匀浆液中制备出的多聚核糖核蛋白体同特定抗体一起保温,形成多聚核糖体同抗体的复合体;

当加入特定蛋白的抗体产生的第二抗体时,产生沉淀,就可以通过不连续蔗糖梯度离心,将所要的含有特定的mRNA的多聚核糖体同总多聚核糖体分离;再通过酚,氯仿抽提去除蛋白及oligo-dT柱亲合层析,就可以得到为特定蛋白编码的mRNA,再通过反转录得到cDNA.

基因的化学合成

基因片段的全化学合成

首先合成一个基因的所有片段,相邻的片段间有4—6个碱基的重叠互补,退火后,用T4DNA连接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基因.

基因的化学—酶促合成

不需要合成完整基因的所有寡核苷酸片段,而是合成其中一些片段,相邻的3'-末端有一短的顺序相互补,在适当的条件下通过退火形成模板—引物复合体,然后在存在四种的条件下,用大肠杆菌DNA聚合酶I大片段填补互补片段之间的缺口,最后用T4DNA连接酶连接及适当的限制性内切酶.

PCR技术在目的基因制备中的应用

目的基因的直接克隆

与常规的基因克隆方法相比,PCR的优点是快速,简单,但是用PCR克隆目的基因的限制是必须知道侧接靶序列的核苷酸序列,以制备引物.因而该法具有很大的局限性.

可直接利用具有平端的PCR产物进行克隆,但利用合适的引物,在待克隆的目的基因二侧引入不同的限制性酶切点,则可将扩增之后的目的基因定向克隆到载体中,避免载体的自身环化,提高克隆效率.

cDNA的克隆

利用PCR技术,只需增加一步逆转录反应,便可从少数mRNA的构建cDNA文库,以mRNA为模板,以oligo(dT)为引物,在依赖于RNA 的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA第一链之后,可通过PCR扩增此链.

如在此链的3'端再加上一段鸟苷酸残基同聚物,则可以使用oligo(dT)和oligo(dC)作为后续PCR扩增的引物,也可酌情在这些引物的5'端加上限制性酶切点,以利于将所得的双链DNA克隆到适当的载体中.

在某些情况下,如已知RNA(或其基因)两端的核苷酸序列,mRNA5'端核苷酸序列或其编码的蛋白质N端的氨基酸序列,便可设计特定的两端引物,用于直接克隆特定的目的基因cDNA,从而省略从cDNA文库中筛选cDNA克隆等序列费时的操作.