历史背景

材料与方法(1 标本 2 方法)

结果

讨论

历史背景

传统巴氏涂片技术的应用已有达50余年，为世界范围内宫颈癌的防治作出了极其重要的贡献。它采用的方法是应用棉签及刮板等采样器在宫颈处采集细胞样本，直接涂抹于玻片上并固定30 min后直接进行染色，其特点：简便快捷，成本低廉，但该技术被认为具有一个天生的缺陷，即细胞收集不全，涂片细胞重叠，着色不良。由于存在上述缺陷，医学专家相继发明了多种细胞学改良技术如TCT、LCT等技术，对于避免传统巴氏涂片的缺陷具有一定的作用，但这些技术操作复杂，需要具备特殊设备及专用耗材，成本高昂，难于普遍推广，实际应用中具有很大的局限，特别是在需要进行大批量细胞涂片检测时，上述技术缺陷表现得更为突出。

为了克服传统巴氏涂片技术的缺陷及其他新技术成本高昂的弊端，一种依据传统巴氏涂片的技术原理进行改良的技术方法，命名为“冷冻式巴氏涂片检测方法”。

材料与方法

1 标本

分别采用传统巴氏涂片及冷冻式巴氏涂片的制片方法进行涂片制作。

2 方法

2.1 操作步骤

标本采集时应用宫颈细胞专用采样器（国家实用新型专利号：ZL200420043365.4）在宫颈移行区进行规范性采样；取样完成后迅速将采样器上的细胞均匀涂抹在清洁的玻片上的一端2/3面积上；带有细胞的玻片迅速置于细胞固定液中固定30 min；固定后细胞玻片送到细胞病理室即刻或稍缓后置于细胞形态修复液中1 min～5 min；经形态修复液处理后的玻片放入冰箱冷冻层内30 min以上或更长时间（不限时长）；冷冻后取出玻片在常温下直接进行HE染色染色、镜下观察并按TBS诊断标准进行诊断。

2.2 HE染色方法

冷冻后细胞玻片水洗1 min；苏木精液染色3 min；流水洗去苏木精液1 s～3 s；1%盐酸乙醇分化1 s～3 s；水洗10 s～30 s；促蓝液返蓝10 s～30 s；流水冲洗10 min～15 min；水洗1 s～2 s；95%乙醇1 min～2 min；沉淀酸化伊红Y乙醇工作液染色1 s～5 s；水洗1 s～2 s；80%乙醇洗1 s～2 s；95%乙醇3 s～5 s；无水乙醇5 min～10 min；石炭酸二甲苯5 min；二甲苯（I）2 min；二甲苯（II）2 min；二甲苯（III）2 min；中性树胶封固，凉干后送细胞诊断室。

2.3 主要染色液的配制

苏木精染液配制:配好苏木精染液是HE染色的关键，苏木精配制有多种配方，关键在于氧化，如加氧化汞作氧化剂时，要防止氧化过度，同时注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸钠作氧化剂时，就无需把苏木精液煮沸。要配制自然成熟的苏木精则不需加氧化剂，但要较长时间才能氧化成熟。不同苏木精染液的染色时间为3 min～20 min，自然氧化成熟的苏木精液染色时间可以更长。我们使用Harri's苏木精配制方法即取苏木精1g，无水乙醇10 ml，硫酸铝钾20 g，蒸馏水200 ml，氧化汞0.5 g，冰醋酸8 ml，分别用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。

沉淀酸化伊红Y乙醇工作液配制:对于巴氏涂片的伊红染色至关重要，选取配制不同的伊红工作液将影响细胞浆的染色。实践中我们认为采用沉淀酸化法配制的伊红Y乙醇工作液，其染色效果极佳，具体如下：取伊红20 g，蒸馏水500 ml,将伊红与蒸馏水充分溶解后加浓盐酸10 ml，用玻璃棒不断搅拌，放置过夜析出沉淀。用一张大号滤纸过滤。滤液不要，加蒸馏水洗涤留在滤纸上的沉淀。蒸馏水过滤后，再加蒸馏水洗，如此反复多次洗涤后，将沉淀物连同滤纸一起放置在恒温箱中干燥，用95%乙醇1 000 ml配成饱和液，此即沉淀酸化伊红Y乙醇饱和储存液。使用时取饱和液1份，加95%乙醇1份。玻片在进入该伊红液前，须先入95%乙醇1 min～2 min。

结果

镜下所见：细胞形态结构清晰，无皱缩自溶现象，细胞着色良好，颜色清晰艳丽，与蓝色的细胞核对比突出，胞浆、核染色质、核仁和其他细胞各成分清晰，细胞境界清楚，细胞分辨度、透明度、对比度良好。与传统巴氏涂片比较，该方法显著地改善了传统巴氏涂片细胞染色欠佳，着色不良，细胞境界难于辨识的弊病。通过上述处理后的涂片即使细胞区域涂具有一定的重叠及炎症细胞过量时，细胞的轮角仍然清晰可现。对于有病变的细胞及相关成分（癌细胞、癌前病变、真菌、挖空细胞等）易于识别，明显提高了诊断率，降低漏诊率。通过前述的规范性细胞取样及涂片，镜下细胞量充足，重叠明显减少，挤压变形的无效细胞量较少。

讨论

以George Papanicolaou博士命名的巴氏细胞涂片方法进行宫颈癌的筛查已有近50 a，对宫颈癌及癌前病变的发现及治疗产生了深刻的影响。由于该项技术操作简便，无需特殊设备，从而得以在许多国家推广并成功地降低了子宫颈癌的发病率和死亡率，但在长期的应用过程中发现，巴氏涂片存在数量不小的漏诊误诊率，因此，有人认为传统的巴氏细胞涂片本身是一项筛查子宫颈癌重要而不完美的筛查方法,相关文献报告中发现传统巴氏涂片对宫颈的高度病变和癌有较高的特异度，但灵敏度偏低。高特异度意味着细胞学能够正确识别那些确实患有高度病变或子宫颈癌的妇女，特异度较低意味着细胞学仅能识别相对少部分患高度病变或癌的妇女，在保持高特异度的情况下很难增加灵敏度。据最近的一些分析报道，巴氏细胞学涂片的灵敏度相当低，在50％左右，有些甚至仅为20％[5,6]。在津巴布韦的一项研究中，巴氏细胞学涂片识别高度病变的灵敏度为44％，特异度为91％，这些研究者指出当卫生决策者制定卫生政策时，应将巴氏涂片检查低灵敏度予以考虑。