病毒载体介导基因技术（病毒包装）

病毒包装的应用领域：

随着分子生物学的理论及技术方法（特别是重组DNA技术）的迅速发展，人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因，使疾病深入至分子水平研究，于是诞生了基因诊断、基因治疗技术。

基因治疗从基因角度理解是对缺陷的基因进行修复增补，或将正常有功能的基因置换的方法。 从治疗角度理解是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。

当代基因治疗研究的热门方法是将外源基因DNA或RNA片段导入靶细胞或组织，研究靶基因的上调或抑制情况。例如，有些异常基因（癌基因、病毒基因），可通过反义核酸技术引入外源片段将其抑制；有些基因本身有治疗作用，体外合成该基因导入体内使其表达丰度提高。

故选择合适高效的基因导入介质系统尤为关键。而病毒载体已成为当前基因治疗载体研究的热点，其优势在于：

1、病毒包装技术经历了多年的研究，已趋于成熟，可用于产业化大量生产。

2、病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚，稳定易于改造、易于制备。

3、病毒的宿主范围广，且具有高效的靶向特异性。

4、在目的基因表达方面相对于脂质体介导的效果更明显、长时、稳定。

5、通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构，安全性高。

锐赛生物公司针对科研院校、医药研究等单位，提供高效高滴度的腺病毒/慢病毒/逆转录病毒的制备服务，用于临床前细胞生物学实验和整体动物实验！

几种病毒载体的区别：

　腺病毒表达系统　慢病毒表达系统　逆转录病毒

病毒基因组成　双联DNA　单链RNA　单链RNA

载导容量　< 8 kb　< 8 kb　< 6kb

基因整合功能　无。病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因　有。病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因　有。

表达丰度　高水平表达　中　中

表达时间　快(1-2天) 　慢（2-4天）　快（1-2天）

感染细胞类型　分裂和不分裂细胞　分裂和不分裂细胞。适用于难转染细胞　感染分裂细胞，但在干细胞中表达效率低

滴度TU/ml　10^12　10^9　10^9

四环素诱导系统　不可以　TET-ON , TET-OFF　不可以

毒性作用　细胞毒性　遗传毒性　遗传毒性

免疫原性　高免疫原性　低免疫原性　低免疫原性

动物模型　不能得到转基因动物　可产生转基因动物，效率达50以上　可以，但很难

安全系数　高　高　中

能否用于MIRCORNA　可以　可以　不可以

RNAi　病毒进入细胞往往引起细胞内干扰素反应，不适合做RNAi实验　适合，是RNAi实验的优选工具　可以用作RNAi实验

基因过表达　包装容量较大。可以满足较大基因的包装，是过表达基因的优选工具　包装容量有限，过表达的基因过大时，病毒滴度受到影响　包装容量有限，过表达的基因过大时，病毒滴度受到影响

常见应用　1、体外细胞基因转导2、基因治疗　1、体外细胞基因转导2、基因治疗　1、体外细胞基因转导2、全基因组插入失活突变筛选3、功能基因库构建

慢病毒包装技术

慢病毒（Lentivirus） 载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

特点：

1、区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，常用于感染难转染的细胞，如原代细胞、神经元细胞、干细胞、不分化细胞、心肌细胞、肝细胞、内皮细胞、肿瘤细胞，且效率近100%

2、可装载DNA片段容量高达8kb

3、目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。

4、病毒载体颗粒通过包装元件和含病毒基因组质粒共转染包装细胞系。利用逆转录机制构建自我失活(SIV)的HIV-1来源的载体,一旦转移到靶细胞后,它就丧失了病毒长末端重复的转录能力,减少了产生重组病毒的机会,并避免了与启动子干扰的问题。

5、锐赛生物公司采用第三代包装系统——四质粒系统只含有HIV-1共9个基因中的3个，即gag、pol、rev。由于HIV-1基因组成分中60 %被去除,因此父代病毒无法复制，是目前重组系数最低的一个慢病毒包装系统，至今未见重组报道。其更安全、更稳定、更高效的技术优势领先于市场上的三质粒及其他包装系统。

综上特点决定了其应用、意义：

1、用慢病毒载体携带目的基因比用质粒瞬时转染更适于稳转株构建。

2、载体带有可进行高效率的包装、转染并稳定整合进靶细胞的基因组中的序列元件，其产生滴度更高，为活体动物模型实验提供高性价比的包含目的基因的病毒液。

3、其高转导效率及整合到基因组的特点为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。

腺病毒包装技术

腺病毒（adenovirus ）

腺病毒颗粒没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35 000 bp，两端各有长约100 bp的反向重复序列。腺病毒的结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组被包装进去，形成有感染能力的病毒颗粒，并最终裂解宿主细胞被释放出去，完成腺病毒的生活周期。

特点：

1、腺病毒具有宿主范围非常广，能感染增殖和非增殖各种细胞，如肝细胞、血管内皮细胞等

2、腺病毒基因组较大（36kb）绝大多数基因组均能被外源基因取代，故插入大片段外源基因的潜力大。

3、不整合到染色体中，目的基因在宿主细胞基因组外游历状态下表达，无插入致突变性，对人致病性低；

4、是瞬时转染，表达快速，容易将外源基因直接转移到靶细胞中，有效表达成活性蛋白。

5、能自行复制，有效进行增殖，产生滴度高；

6、与人类基因同源；

7、能在同一细胞株或组织中设计表达多个基因。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。

8、锐赛生物公司腺病毒载体通过对各元件的改造，进一步降低了集体的免疫反应和细胞毒性，提高了安全性，并提高了外源基因的靶向性表达。

综上先病毒载体的特点，产生了其应用和意义：

1、应用于体内接种疫苗。用携带免疫调节基因或肿瘤特异抗原已近的腺病毒载体转入相应肿瘤细胞以诱导抗肿瘤免疫反应，可制成具有抗肿瘤活性的瘤苗。

2、应用于信号转导，基因转位，Co-IP，动物实验，干细胞研究等科研实验。

3、可以完成较高难度的克隆构建，包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建，在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。

4、产生滴度高，非常适于基因治疗。例如：Rosenfeld等用构建的含肌糖原磷酸化酶cDNA的重组腺病毒感染肝细胞，糖原磷酸化酶活性增加46倍，提示可以对糖原蓄积疾病进行基因治疗。

逆转录病毒包装技术

逆转录病毒

一类含有逆转录酶的单股正链RNA病毒。慢病毒是逆转录病毒科中的亚科

原理：

逆转录病毒侵入宿主细胞后以自身RNA为模板，靠逆转录酶形成DNA环化后整合到宿主细胞的染色体中，以原病毒形式在宿主细胞中复制。

逆转录病毒的共同特性——

1、球形，有包膜，80~120 nm

2、基因组：单股RNA二聚体，核心有逆转录酶

3、复制通过DNA中间体，能与宿主细胞DNA整合

应用：

1）基因转染和稳定表达

2）具有在基因治疗和生物制药等领域的应用潜力

实验服务流程