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词条 保护碱基
释义

定义

限制性内切酶识别特定的DNA序列,除此之外,酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基,这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的,被称为保护碱基。

原理

在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计PCR引物时,人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列,即保护碱基,用来提高将来酶切时的活性。

其次,在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时,相临的两个酶切位点往往不能同时使用,因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

添加原则

添加保护碱基,需要考虑两个因素:一是碱基数目,一是碱基种类。

添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数目,而不是种类。什么样的酶切位点,添加几个保护碱基,是有数据可以参考的,见附表。

添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小,GC%较低,添加时多加G或C,反之亦反。

附表

Fermentas提供的保护碱基数目和酶切活性对应值表

注:酶切活性值出现空格时参考前一格。

内切酶 碱基数目和酶切活性(%)

1 2 3 4 5

AarI 20-50   50-100

AasI 50-100

AatII 0 0-20 20-50  50-100

Acc65I 0-20 50-100

AdeI 50-100

AjiI 50-100

AluI 0-20  20-50 50-100

Alw21I 50-100

Alw26I 50-100

Alw44I 0 20-50 50-100

ApaI 50-100

BamHI 50-100

BauI 0-20 20-50 50-100

BcnI 20-50   50-100

BclI 0 50-100

BcuI 50-100

BfiI 50-100

BfmI 50-100

BfuI 50-100

BglI 20-50 50-100

BglII 0 50-100

Bme1390I 20-50   50-100

BoxI 0 50-100

BpiI 50-100

Bpu10I 20-50 50-100

Bpu1102I 50-100

BseDI 0 50-100

BseGI 50-100

BseJI 0 50-100

BseLI 0 50-100

BseMI 0-20 50-100

BseMII 50-100

BseNI 0 50-100

BseSI 50-100

BseXI 20-50 50-100

Bsh1236I 50-100

Bsh1285I 0-20 50-100

BshNI 50-100

BshTI 20-50 50-100

Bsp68I 0 50-100

Bsp119I 50-100

Bsp120I 20-50 50-100

Bsp143I 50-100

Bsp1407I 20-50 50-100

BspLI 50-100

BspPI 0 50-100

BspTI 0 0-20 50-100

Bst1107I 0-20 50-100

BstXI 0   50-100

Bsu15I 50-100

BsuRI 0-20 20-50 50-100

BveI 0-20   50-100

CaiI 0 0-20 50-100

CfrI 0 50-100

Cfr9I 20-50 50-100

Cfr10I 20-50 50-100

Cfr13I 50-100

Cfr42I 50-100

CpoI 50-100

CseI 50-100

Csp6I 50-100

DpnI 50-100

DraI 0 0-20 50-100

Eam1104I 0 50-100

Eam1105I 0 50-100

Ecl136II 50-100

Eco24I 50-100

Eco31I 20-50   50-100

Eco32I 20-50 50-100

Eco47I 50-100

Eco47III 0 0-20 50-100

Eco52I  0-20 50-100

Eco57I 50-100

Eco57MI 50-100

Eco72I 0-20 50-100

Eco81I 50-100

Eco88I 50-100

Eco91I 20-50 50-100

Eco105I 20-50 50-100

Eco130I 0   50-100

Eco147I 0 50-100

EcoO109I 50-100

EcoRI 50-100

EcoRII 0 0-20 20-50 50-100

EheI 20-50   50-100

Esp3I 50-100

FaqI 0-20 50-100

FspAI 0-20 20-50 50-100

FspBI 20-50 50-100

GsuI 50-100

HhaI 50-100

Hin1I 50-100

Hin1II 0 0-20 50-100

Hin6I 0   0-20 50-100

HincII 50-100

HindIII 0 0-20 50-100

HinfI 50-100

HpaII 0-20 50-100

HphI 0 50-100

Hpy8I 0-20 50-100

HpyF3I 20-50 50-100

HpyF10VI 50-100

KpnI 50-100

Kpn2I 0 50-100

KspAI 20-50 50-100

LguI 50-100

LweI 20-50 50-100

MbiI 0 0-20 50-100

MboI 50-100

MboII 50-100

MlsI 0-20 50-100

MluI 20-50   50-100

MnlI 0 50-100

Mph1103I 20-50 50-100

MspI 0-20 50-100

MssI 20-50 50-100

MunI 20-50 50-100

MvaI 0  20-50 50-100

Mva1269I 0 50-100

NcoI 0 50-100

NdeI* 0-20 20-50 50-100

NheI 0 20-50   50-100

NmuCI 20-50 50-100

NotI 20-50 50-100

NsbI 0 0-20 50-100

OliI 0-20 20-50 50-100

PaeI 0 0-20   20-50 50-100

PagI 20-50 50-100

PasI 50-100

PauI 0 50-100

PdiI 0-20 50-100

PdmI 50-100

PfeI 50-100

Pfl23II 0-20 20-50 50-100

PfoI 0 20-50 50-100

Ppu21I 50-100

PscI 0 50-100

Psp5II 0 50-100

Psp1406I 0-20 50-100

PsuI 0-20 50-100

PstI 0-20 50-100

PsyI 0 50-100

PvuI 20-50   50-100

PvuII 50-100

RsaI 50-100

SacI 50-100

SalI 20-50   50-100

SatI 0 50-100

ScaI 0-20 50-100

SchI 50-100

SdaI 0-20 50-100

SduI 50-100

SfiI 50-100

SgsI 50-100

SmaI 50-100

SmiI 0-20 50-100

SmoI 0 50-100

SmuI 50-100

SsiI 50-100

SspI 0-20 50-100

TaaI 20-50 50-100

TaiI 50-100

TaqI 0 20-50   50-100

TasI 0 20-50 50-100

TatI 0-20   20-50 50-100

TauI 20-50 50-100

Tru1I 0 0-20   50-100

TsoI 20-50 50-100

Van91I 0 50-100

VspI 50-100

XagI 20-50 50-100

XapI 20-50   50-100

XbaI 20-50 50-100

XceI 0 50-100

XhoI 0-20 50-100

XmaJI 50-100

XmiI 50-100

I-SceI 50-100

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更新时间:2025/3/21 12:18:06