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词条 免疫组化技术
释义

前言

免疫组织化学(Immunohistochemistry)又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支,它是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测技术。

1.发展简史

——1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。

—— 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。

—— 70年代 Stemberger 改良上述技术,建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶(PAP)技术,使免疫细 胞化学得到广泛应用。

—— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素(ABC)法之后,免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜 技术相继问世。

—— 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。

——2000年 各种免疫组化技术更加成熟,使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的 一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科,是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。

2.免疫组织化学的技术分类

(1)根据染色方式分成:① 贴片染色

② 漂浮染色

(2)根据Ag—Ab结合方式分成:

① 直接法

② 间接法

③ 多层法

(3)按标记物的性质分成:

① 免疫荧光技术(免疫荧光法)

② 免疫酶技术(酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法)

③ 免疫金属技术(免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法)

3.标记物

(1)必要性:组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的,若在镜下检测,则必须具有可视性标记物。

(2)常用标记物

① 荧光素:最常用的是异硫一氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate ,FITC) —— 荧光显微镜下 呈绿色荧光

四乙基罗达明(rho—damine RB200)——荧光显微镜下发橙红色荧光

② 酶:辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。

③ 生物素:(Biotin)

④ 铁蛋白金等:主要应用于免疫电镜。其他:如同位素(因涉及污染和防护难一般不用)

4.应用

凡是组织细胞内具有抗原性的物质,如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示,因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年,分子生物学研究异常活跃,但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位,进而深入研究其功能。

一、免疫组织化学技术

(一)染色方法

1.直接法

荧光素直接标记特异性抗体(—抗)上,标记抗体与抗原结合(在切片上)荧光显微镜下观察→检测抗 原。

酶标抗体要显示后镜检。

直接法优点:简单,时间短,特异性强。缺点:灵敏度低,所需抗体量大(不经济)。应用:基本不用!

2.间接法 荧光素标记在二抗上(二抗:抗产生一抗动物的 IgG抗体)。

显色后镜检

特点:较直接法灵敏,可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原。

3.非标记Ab桥法:

“桥法”是酶标记抗体的改进,经过三次抗体,其二抗为未标记桥抗体。

(1)单桥法

(2)双桥法

在三抗之后,将二抗和三抗再重复一次,

可增大染色强度。

特别提示:注意动物种属关系

4.PAP法(过氧化物酶—抗过氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method, PAP法)

~ 是桥法的改良,既先形成PAP复合物→抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。

该法简化了操作步骤,提高了灵敏度,所染标本可长期保存。

5.ABC法(亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法,Avidin—biotin—peroxidase Complex method,ABC 法)

Avidin: 亲和素,一种糖蛋白,其上有4个与生物素相结合的位点。

Biotin : 生物素—维生素H,两者亲和力巨大,牢不可破。

ABC法与PAP法的区别是:以ABC复合物代替PAP复合物。

(1)ABC复合物的制备:

(2)ABC法反应原理

6.SP或SAP法(过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色) Streptavidin/peroxidase or strepta-vidin/alkaline phosphatase)

该法是ABC法基础上的进一步改良,使卵白素与链霉(而非生物素)结合,而后再结合PO 。

它有4个亚基可与生物素结合,灵敏特异, 背景低,成本低。

现在还有plus盒。优点是:更简便,放大倍数↑,等电点中性更适合组织。分子量小,穿透力↑。

7.蛋白A—金法(Protein—A gold method)

~多用于电镜

8.双重组化染色法

应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片,同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。

9.免疫金—银染色法

(Immunogold—silver staining IGSS)

(二)固定——见前述

注意事项:

1.固定剂的选择:因组织而不同,注意质量和

性能。

2.固定方式的选择:① 浸渍固定(参考文献)

② 灌注固定(+后固定)

③ 蒸汽固定

(三)免疫组化染色步骤(以ABC法为例)

1.切片脱蜡入水,入PAS 洗三次/15分钟。

2.封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3%H2O2 (在PAS或0.05Tris—HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中)室 温,30 分钟。

3.水洗,入PBS,洗三次,每次5分钟。

4.减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清(产生二次抗体动物血清!),室温,30分钟。

5.滴加第一抗体,4℃过液或室温5′~1 hour。

6.0.1MPBS,洗三次,每次5分钟。

7.滴加第二抗体,室温15′~ 60′。

8.0.1MPBS 洗净,洗三次,每次5分钟。

9.滴加ABC复合物,室温15~60分钟。

10.0.1MPBS 洗三次,每次5分钟。

11.0.05M Tris –HCL 5~10分钟,此步可省略。

12.DAB—H2O2 显色:用0.01%H2O2的DAB溶液,室温5~30分钟,随时镜检(DAB用时新配)

13.自来水洗净。

14.用Mayer 苏木精或0.5%甲基绿,复染胞核(可不染)。

15.常规脱水、透明、封固、镜检。

结果:棕褐色反应产物代表抗原X的定位。

(四)免疫组化染色基本技术及注意事项

1.实验计划

① 根据课题的内容选用动物,选用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗体,与其他种属间无 交叉,则不能用其他 动物,而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠,若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠,否则不能连接成复合物。

② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异,在贴片方面最好贴于同一张载片上,否则无可比性。

③ 选用的试剂可靠,货源充足,随时可取。

2.Ab稀释度 (如系购买的药盒有工作液和原液)

(1)工作液:无须稀释

(2)原液:

① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。

如:工作液浓度为1∶1000, 可选1∶500,1∶1000,1∶1500试验;

若: 1∶500有背景,1∶1000阳性反应稍浅,可选1∶750进行试验。

② 原液的保存(—20℃)冻存——应选最佳稀度冻存。

③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍,而后分装10μl/瓶→冻存(-20 ℃)于 冰箱备用。

④ 关于Ab保存应参照说明书。

(3)Ab浓度的选择

Ab浓度不可太高或太低,因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行,若一方过剩则形成复合物小且少;极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。——并非Ab浓度越高越好。

3.Ab滴片技术

—— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。

[注意] 滴抗体前需把切片上的水弄干,但不能干片。

要领:甩净组织周围的水。

4.PBS洗涤技术

(1)洗涤的目的

① 保证离子浓度和PH值。

② 减少非特异反应(平时Ab不可靠很纯)

(2)方法:洗三次,每次5分钟。

5.Ab孵育技术

(1)必须在湿盒内进行,以防抗体的蒸发和干片。

(2)温度与时间 4℃:过夜;

37℃:2 h or 参考说明书

6.光镜控制显色方法

(1)室内操作:注意温度与时间的关系,室温最宜5分钟。

(2)染色稍浅亦可拿出,脱水,封片后颜色可加深。

(五)对照组和染色结果的评价

从以下几 个方面综合评价:

1.阳性染色特点

① Ag定位,胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。(非特异性~细胞与组织无区别)

② 染色强度不同:颜色深浅不一(非特异性染色 弥散性均匀)

2.组织切片制作过程的影响

① 固定不良—非特异性染色,显示不均。

② 边缘干燥—非特异性染色(常见),加抗体时勿干片。

3.人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。

阳性对照:

用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果,标为阳性对照。

阴性对照:

用确证不含已知抗原的标本作对照,应呈阴性结果,称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种,阴性对照 还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。

染色失败的几种原因:

(1)所染的全部切片均为阴性结果,包括阳性 对照在内。全部(-)原因可能:

① 染色未完全严格按照操作步骤进行;

② 漏加一种抗体,或抗体失效;

③ 缓冲液内含叠氮化钠,抑制了酶的活性;

④ 底物中所加H2O2 量少或失效;

⑤ 复染或脱水剂使用不当

(2)所有切片均呈阳性反应,原因可能是:

① 切片在染色过程中抗体过浓,或干燥了。

② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确,洗涤不彻底。

③ 使用已变色的呈色底物溶液,或呈色反应时间过长。

④ 抗体温育的时间过长。

⑤ H2O2 浓度过高,呈色速度过快。粘附剂太厚。

(3)所有切片背景过深,原因可能是:

① 未加酶消化处理切片。

② 切片或涂片过厚。

③ 漂洗不够。

④ 底物呈色反应过久。

⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

⑥ 使用全血清抗体稀释不够。

(4)阳性对照染色良好,检测的阳性标本呈阴性反应。

最常见的原因是:标本的固定和处理不当。

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