| 词条 | 蓝白斑筛选 |
| 释义 | § 简介 蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 § 概述 宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。 § 原理 大肠杆菌β-半乳糖苷酶可分成2部分即α肽段（N-端的146个aa）和C-段。α肽段的基因位于载体上并含有不影响其ORF（open reading ）的多克隆位点（MCS），而C-段的基因位于工程菌E. coli DH5α上。二者在同一菌株中表达时，菌株中的C-段与载体上的α肽段互补而具有酶活性，能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。在MCS上插入新基因将会改变其ORF而使得载体上的α肽段不能与菌株中的C-段互补而不能无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝产生白斑。选择转入的阳性克隆即选择白斑。 [1] § 适用方面 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。 操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。 § 影响转化率的几个重要因素 ⑴、受体细胞 转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，它可容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 另外还应根据载体的性质及实验的目的选择合适的宿主。 此外，受体细胞生长状态和密度也很重要。不要使用经过多次转接或储存于4℃的培养菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。 ⑵、载体DNA和重组DNA方面 载体本身性质决定了转化的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化效率不同。载体的空间构象也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间上难以恢复，其转化率常比cccDNA低两个数量级。对以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。 ⑶、操作方面 感受态细胞的制备对转化率影响较大。一般未经特殊处理的培养细胞对重组DNA分子不敏感，难以转化成功。为防止杂菌和杂DNA的污染，整个操作均应在无菌条件下进行，所有器皿最好是新的，并经高压灭菌处理，所有试剂也都要灭菌处理。 ⑷、转化体系中重组DNA的浓度与纯度 转化体系中重组DNA的浓度与纯度对转化率也有一定影响。在一定浓度范围内，浓度越高，转化率越高，重组DNA纯度越高，转化率越高。 ⑸、外源基因与宿主染色体的同源性 外源基因来源与宿主亲缘关系越近，越易整合到宿主染色体中，转化率越高，否则易被宿主核酸酶降解而降低转化率。 § 实验试剂 X-gal：2%母液（用二甲基甲酰胺配制，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，-20℃保存备用），工作浓度20ul/20ml平板； 氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg/ml母液，置-20℃冰箱保存。工作浓度100ug/ml； IPTG：母液100mmol/L，-20℃冰箱保存。工作浓度40ul/20ml平板； LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，用NaOH调pH到7.2，121℃灭菌20min备用。固体LB培养基则在LB液体培养基中添加1.5%～2%琼脂，灭菌后备用； 含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为100ug/ml，摇匀后铺板； 大肠杆菌DH5a。 试剂的作用： X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷）：一种人工化学合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖苷酶水解产生兰色化合物。 IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，很强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，它可诱导LacZ的表达。 实验器具 超净工作台；恒温水浴锅；制冰机；微量移液器；恒温摇床；常温离心机；恒温生化培养箱；冰箱；培养皿；玻璃刮铲。 § 实验步骤 ⑴、取4ul连接产物加入100ul感受态细胞中，用枪轻轻吹打均匀，冰浴30min。 ⑵、将管置于水浴锅中42℃水浴热激90sec，立刻放置冰上5min。 ⑶、加入1ml 37℃预热的LB培养基，混匀。 ⑷、将管置于恒温摇床上37℃振荡培养1h。 ⑸、将管置于离心机中3000rpm离心5min。 ⑹、弃1ml上清，余下约100ul上清，用枪轻轻吹匀，用于涂板。 ⑺、在一含氨苄青霉素的LB平板上，加入20μl 20mg/ml X-gal和40μl100mmol/L IPTG。 ⑻、将玻璃刮铲过火灭菌后伸入培养平板中，待其冷却后均匀涂布平板，玻璃刮铲过火灭菌后置于酒精中备用，平板于室温放置30min备用。 ⑼、将前述所得含重组子的菌液吸至制备好的含X-gal的平板上，用玻璃刮铲均匀涂布。将平板置于生化培养箱中正面放置30min后，再倒置，于37℃培养过夜。 § 注意事项 1、质粒的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的10％。 2、防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 3、显色反应的时间 需要将平板放入4℃冰箱中3-4h，使得显色反应充分。 4、平板的涂布 菌液涂平板的时候要避免来回涂布，否则过多的机械挤压涂布会导致细胞破裂，影响转化效率。 |
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