myc基因简介

简介

myc基因的分类和功用

c-myc癌基因结构及表达

C-myc基因的表达产物及功能

myc癌基因与人类肿瘤

myc基因临床意义

论文

讨论

结果(一、材料 二、方法)

myc基因简介

myc基因是较早发现的一组癌基因，与之同源的病毒癌基因存在于MC29及其它一些具有高度致癌性的猿逆转录病毒中。myc基因高水平表达时可转化啮齿类成纤维细胞。

简介

myc基因是较早发现的一组癌基因,包括C - myc，N -myc，L - myc ，分别定位于8号染色体，2号染色体和1号染色体。结构上由不编码蛋白质的第1外显子和编码蛋白质的第2、3外显子构成。myc基因属于编码核蛋白的癌基因，3个基因都编码一种与细胞周期调控有关的核内DNA结合蛋白。myc基因家族及其产物可促进细胞增殖，永生化，去分化和转化等，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位。myc基因家族中的3个成员对肿瘤形成及在肿瘤类型方面存在差异。目前认为，C - myc的扩增与肿瘤发生与转归密切相关，N - myc的扩增对肿瘤的预后判断有意义，L - myc扩增与肿瘤的易患性和预后在不同的肿瘤中表现不一样。近年来的研究表明，myc基因产物，尤其是c - myc在诱导细胞凋亡过程中也起重要作用。

myc基因首次在Burkitt淋巴瘤中发现，可通过染色体易位而活化，最常见的是通过8号染色体与14号染色体间易位，使得8号染色体上的myc基因或其相邻区域与14号染色体的免疫球蛋白重链融合而被活化。myc基因还可以通过染色体2：8或8：22间易位与免疫球蛋白轻链序列融合而被活化。尽管不同肿瘤中影响myc基因的易位断裂点的具体位置可能有所不同，但染色体易位的共通之处是改变了myc基因正常的表达调控机制。

除了染色体易位可破坏myc基因的表达调控之外，在某些肿瘤类型中myc基因还受DNA扩增的影响。myc基因在小细胞肺癌中有较高频率扩增，在很多其它类型上皮癌如乳腺癌和结直肠癌中也有扩增。

myc基因的分类和功用

myc基因包括C - myc，N -myc，L - myc，分别定位于8号染色体，2号染色体和1号染色体。结构上由不编码蛋白质的第1外显子和编码蛋白质的第2，3外显子构成。myc基因属于编码核蛋白的癌基因，3个基因都编码一种与细胞周期调控有关的核内DNA结合蛋白。myc基因家族及其产物可促进细胞增殖，永生化，去分化和转化等，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位。myc基因家族中的3个成员对肿瘤形成及在肿瘤类型方面存在差异。目前认为，C - myc的扩增与肿瘤发生与转归密切相关，N - myc的扩增对肿瘤的预后判断有意义，L - myc扩增与肿瘤的易患性和预后在不同的肿瘤中表现不一样。近年来的研究表明，myc基因产物，尤其是c - myc在诱导细胞凋亡过程中也起重要作用。

c-myc癌基因结构及表达

c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的细胞同源序列，从MC-29病毒 中分离的V-myc是gag-myc融合体，它由1358个bp的gag基因与1568个bp的V-myc基因共 同组成.C-myc基因由3个外显子及2个内含子组成，第一个外显子不编码，只起调节作 用，只有外显子2和3与V-myc相对应，编码一个439个氨基酸的蛋白质.C-myc基因由启 动子P1或P2起始转录并在第一内含子中尚有一个潜在启动子P，当第一个内含子发生 断裂时，P可被激活而成为一个异常转录起始点，但蛋白合成起始位点不变，并与正 常C-myc基因产物相同.在各种不同动物中，C-myc基因和第2.3外显子具有高度保守 性，而第1外显子则有较大的差异.小鼠和人的外显子1只有70%的同源性.人类C-myc基 因定位于8q24.在生理学上，C-myc基因的表达一般与细胞的生长状态有关，如有生长 因子刺激成纤维细胞，可导致C-myc表达增强，相反，在细胞分化时C-myc表达降低， 在细胞培养过程中，用C-myc表达结构或反义寡脱氧核酸进行研究，发现C-myc在细胞 G0期到S期的过程中也起作用.表明C-myc表达的变化与细胞的增殖及分化状态有关， 其表达产物在调节细胞生长、分化或恶性转化中发挥作用。

C-myc基因的表达产物及功能

C-myc基因的产物为62KD的磷酸化蛋白P62c-mgc，是由C-myc基因的外显子2和3共 同编码的由439个氨基酸组成的蛋白质，定位细胞核内，为核蛋白，依C-one编码产 物，功能分类，C-myc癌基因属核蛋白基因，具有转化细胞的能力，并具有与染色体 DNA结合的特性，在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用.C-Myc蛋白在结构上 可分为转录激活区，非特异DNA结合区，核靶序列，碱性区，螺旋一环一螺旋(HLH)及 亮氨酸拉链区，在已知的转录因子中可介导蛋白的寡聚化，这两个区同时存在是 C-myc蛋白所特有的，在其它蛋白质中，很少发现.在C-Myc蛋白中，螺旋一环一螺旋 紧随着碱性区，揭示其以特异性序列方式和DNA相互作用.在以原核生物为实验对象的 研究表明，该碱性区以一个自由环存在，当以特殊方式结合到DNA上时，则变成螺 旋，该区是C-Myc蛋白与DNA特异序列的结合部位.

在C-Myc中还存在着与抑制细胞分化、自身抑制有关的区域及肿瘤转化所必需的 区域.Smith等研究了C-Myc的亮氨酸拉链区，该区介导各种转录因子的二聚作用.在亮 氨酸重复部位的突变能显蓍降低C-myc抑制鼠红白血病(MEL)细胞分化能力，同样地， 此区的插入突变能消除C-Myc的转化活性.正是这些C-myc结构成分的表达阻止了细胞 进入细胞周期，从而抑制许多细胞系的分化.Cronch等对C-Myc亮氨酸拉链区的亮氨酸 进行致突变，发现这些突变不能自身抑制，说明了亮氨酸拉链区在自身抑制中的重要 性.Stone等研究认为，C-Myc分子的中间1/3以及N-端，C-端是肿瘤转化所必需的，是 C-myc基因与肿瘤转化有关的C-myc区段.正是由于这些C-Myc功能区域的存在，从而使 C-Myc在胞浆内合成后，与其它蛋白形成寡聚体，再转移到核内，并结合到特异性的 DNA序列上，从而激活和抑制许多靶基因的转录，引起细胞生长和分化的改变，发挥 其生理调节功能及恶性转化作用.

近年来对疗程性细胞死亡Programmed Cell death. PCD)研究的深入，发现Myc蛋 白参与诱导细胞凋零.C-myc基因表达的失调是多种细胞凋零的主要诱因，细胞发生凋 零的速度及其对诱导因素的敏感性均依赖于细胞Myc蛋白的含量.尚未成熟胸腺细胞中 Myc基因的高表达是胚胎胸腺细胞凋零死亡的诱因.而且在凋零细胞的死亡阶段，也观 察到C-myc基因的高水平表达，如果用反义寡核苷酸阻断C-myc基因的表达，则细胞凋 零受到严重干扰.Evan研究发现，C-myc表达的失调也会启动去除生长因子后培养细胞 的成熟前凋零.他们对小鼠IL-3依赖性髓样细胞素32D进行观察，发现在洗去IL-3后， 可立即观察到C-myc基因表达下调.结果使培养细胞停止于G1期，将携带C-myc基因的 载体转染32D细胞，获得稳定表达C-myc基因的32D细胞克隆，结果这种细胞去除H-3 后，不停止于G1期，而是启动以凋零为特征的程序性细胞死亡.结果揭示细胞凋零是 清除固定突变及细胞周期调控失衡的细胞的重要机制，一旦细胞发生障碍，C-myc基 因会启动凋零程序，相反，则导致肿瘤形成。

myc癌基因与人类肿瘤

myc基因定位于染色体8q24、IgH、IgK、Igλ链的基因位点分别在14q32、2P13和 22q11，在BL细胞中往往出现C-myc基因位点与Ig基因位点之间的易位，即C-myc易位 到Ig位点的高活性转录区，从而组成一个高转活性的重排基因，启动C-myc转录，使 C-myc表达增强，促进细胞恶变，最后导致肿瘤的发生.

C-myc基因主要通过扩增和染色体易位重排的方式激活，与某些组织肿瘤的发 生、发展和演变转归有重要关系.在不同的人体肿瘤细胞系中，包括粒细胞性白血病 细胞系，视网膜母细胞瘤细胞系，某些神经母细胞病细胞系，乳腺癌细胞系及某些肺 癌细胞系，已发现C-myc或C-myc相关序列的扩增，在人结肠癌细胞系中也观察到 C-myc基因的扩增.C-myc癌基因已在成骨肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、横纹 肌肉瘤中发现扩增，当扩增达到30倍时，染色体上表现HSR和DMS，而且C-myc过量表 达与肿瘤的早期复发有关，在致瘤中，已发现ras与myc、sis与myc、myc与fos偶联激 活，协同致瘤等.

许多资料表明C-myc位点在所有受检的B细胞肿瘤中有重排，Casares等发现定位 在8号染色体上的C-myc与定位在14号染色体上的Ig重链基因有同样的14.2Kb的ecori 酶切片段，因而发生8∶14易位可能是何杰氏淋巴瘤的一个普通标志.N-myc在人神经 位母细胞瘤.视网膜母细胞瘤和小细胞肺癌中有扩增，扩增的程度与肿瘤的发病进程 有关.Schwab等报告20%的神经母细胞瘤有N-myc扩增，其中大多数是侵袭性肿瘤.Seege r等报告基因拷贝数的多少预示疾病的进程，总的来说，带有一个拷贝数的Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ.期神经母细胞瘤常规治疗效果较好，带有多个拷贝的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期病人，病 情将不断加重.c-myc首先被发现与小细胞肺癌有关，30%的病例c-myc扩增，复发病人 中，myc扩增者的生存期短于没有扩增的病例，研究还发现接受化疗的肿瘤病人易引 起myc扩增.有关myc基因扩增与其它肿瘤的关系也有许多报道.目前认为胃癌、乳腺 癌、结肠癌、宫颈癌、何杰金氏病及头部肿瘤等都有myc基因的扩增或过度表达

myc基因临床意义

过度表达，见于各种肿瘤，如肺癌，胃癌，乳腺癌，结肠癌，宫颈癌，某些神经母细胞病，粒细胞性白血病 ，视网膜母细胞瘤，成骨肉瘤，软骨肉瘤，脊索瘤，脂肪肉瘤，横纹肌肉瘤，何杰金氏病及头部肿瘤等都有myc基因的扩增或过度表达。建立同时检测Myc基因3个成员L-myc 、N-myc及C-myc异常扩增的简便方法。方法　采用聚合酶链反应(PCR)技术，用一对引物同时扩增Myc基因3个成员第2外显子中的高度保守区，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及激光扫描。结果　此法可以检测Myc基因家族中3个成员的扩增情况。 经检测，正常组织细胞没有Myc基因扩增，32例喉癌组织中47%有L-myc和C-myc扩增，41%有N-myc 扩增，与正常比差异均有显著意义(χ=6.764,7.609, 5.961;P均<0.05)。C-myc扩增率与用PCR-琼脂糖凝胶电泳检测的结果基本相符(χ=0.254,P>0.05) 。结论　此法对检测肿瘤组织中Myc基因3个成员提供了简易、特异、 无放射污染，并且适于临床应用的、优于PCR-琼脂糖凝胶电泳的方法。

论文

至今Myc基因已被发现了至少3种，C-myc、N-myc和L-myc

讨论

目前，国内外用于检测N-myc、L-myc及C-myc的方法大多采用各种杂交技术。由于应用放射性同位素，需要各种防护措施，不安全又复杂，且一次只能检测Myc基因家族中的一个基因，临床上很难常规应用。PCR－琼脂糖凝胶电泳技术简单、易行、快速，但由于灵敏度低，不能分开只相差3个bpDNA的L-myc和N-myc，所以只能检测C-myc的相对扩增，而不能检测N-myc或L-myc扩增或二者的同时扩增。而且，如果有N-myc或L-myc扩增或二者同时扩增时，即使有C-myc扩增，也会出现假阴性结果。我们首先把PCR技术与中性聚丙烯酰胺凝胶电泳及激光扫描技术结合起来，并用硝酸银试剂使凝胶上的Myc 基因双链染成黑褐色。这样的实验结果特异性高，方法简单，成本低，又避免了放射性同位素的一切弊端，很适合于临床应用。聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，具备分离只相差一个核苷酸的不同DNA片段的特性。在中性聚丙烯酰胺凝胶中，双链DNA片段的电泳迁移率主要由DNA片段长短决定，而与其碱基组成和顺序基本无关。基于以上原理，我们设计了此实验，目的是能把琼脂糖凝胶电泳上没有分开的只相差3 bp的N-myc和L-myc分开，作到一次可同时检测3种Myc基因的扩增情况。实验表明：用PCR-中性聚丙烯酰胺凝胶电泳和用PCR-琼脂糖凝胶电泳检测C-myc基因结果基本相符， 说明本研究建立的方法结果可靠。Myc基因是较早发现的一组癌基因，Myc基因的异常扩增或表达，参与了很多肿瘤的发生和发展。本研究方法对进行3种Myc基因在肿瘤形成过程中作用机理的研究，提供了简便易行的实验手段。

结果

1.PCR-琼脂糖凝胶电泳结果：实验设计的引物扩增Myc 3种基因，经PCR扩增，喉癌组织及正常组织细胞DNA在琼脂糖凝胶上均可见2条小于300 bp 的电泳带。第1条带为N-myc( 230bp)和L-myc(227 bp)2个DNA片段合成带，因两者只相差3 bp，故琼脂糖凝胶电泳不能将其分开而呈现1条带；第2条电泳带为C-myc基因(244 bp)。 将电泳结果拍照后的底片在激光扫描仪进行扫描，得出2条带的峰面积值。正常组织细胞的C-myc带比N-myc和L-myc合成带密度弱，比值小于1，求出正常组织细胞的C×(N+L)均值为0.6 。

C-myc扩增倍数=喉癌的C×(N+L)×0.6，考虑实验中的综合因素，定为1.5倍以上有C-myc扩增。结果显示：喉癌中有42%的C-myc扩增，正常组织细胞没有C-myc的扩增。

2.PCR-中性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：由于中性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA的分离特性，经PCR扩增后的Myc基因电泳带显示3条。第1条带为L-myc(227 bp)，第2条为N-myc(230 bp)，第3条为C-myc(244 bp) 。将扩增出特异性Myc基因电泳带的凝胶片，直接在激光扫描仪上进行扫描，得出3条带的峰面积值。然后用各自的峰面积值除以各自的碱基数，作为该基因的单拷贝数，将L-myc、N-myc和C-myc三者中最小的单拷贝数设定为1，比较其他2个基因的相对倍数。正常组织细胞L-myc∶N-myc∶C-myc均值为1.0∶2.2∶3.8。结果32例喉癌中47%有L-myc和C-myc的扩增，41%有N-myc扩增。C-myc的扩增率与用PCR-琼脂糖凝胶电泳检测的结果基本一致(χ=0.254，P>0.614)。

一、材料

1.标本：32例喉癌组织取自我院耳鼻咽喉科住院病人，7例正常喉组织取自我科同期住院的非癌症病人，3例正常白细胞取自我院血库人全血。所有标本均经病理证实。根据喉癌组织病理分化程度不同，分为高、中、低分化癌。

2.PCR引物：5′-CCCAGCGAGACATCTGGAAGAA-3′，5′-GAGAAGCCGCTCCACATGCAGTC-3′。扩增Myc基因家族的3个基因，即C-myc(244 bp)，N-myc(230 bp)，L-myc(227 bp)，由上海复旦大学遗传学研究所合成。

3.试剂：TaqDNA聚合酶、dNTP为Promega公司产品；蛋白酶K为Merke公司产品；硝酸银为沈阳试剂二厂产品；Marker PUC 18质粒DNA HeaⅢ酶切片段为Sigma公司产品。

二、方法

1.模板DNA提取：参照参考文献[3]方法进行。

2.PCR扩增：PCR扩增总反应体积50 μl，应用模板DNA 50 ng，在DNA扩增仪操作(Perkin Elmer Cetus)，循环周期为94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，经过30个循环后，补加72℃7分钟。

3.琼脂糖凝胶电泳步骤：取PCR产物5 μl加1μl上样缓冲液(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯氰FF，40%蔗糖水溶液)之后备用。制备2%琼脂糖凝胶倒入水平式电泳槽中。待胶凝固后加样，用1×TAE缓冲液作为电极缓冲液，溴化乙锭染色，电压低于5V/cm，时间约为2小时。电泳结束后，凝胶直接在紫外透射仪上观察结果。照像，拍片后的底片在激光扫描仪上进行扫描。

4.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：取PCR产物5 μg加1 μl上样缓冲液之后备用。制备8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注于20 cm×20 cm×0. 1 cm垂直板电泳槽中， 待凝胶聚合后加样，用1×TBE缓冲液作电极缓冲液，室温下电泳1瓦特约14小时，待指示剂溴酚蓝移到边缘时停止电泳。将电泳后的凝胶移至方盘中进行硝酸银染色。染色过程如下：用双蒸馏水(dH2O)洗凝胶3次后浸泡于染色液(硝酸银1g，加dH2O至500 ml)中30分钟，去掉染色液，用dH2O漂洗3次凝胶，然后浸泡于显色液(NaOH15g，38%甲醛3.8 ml，加dH2O至500ml)中约10分钟，当显出棕黑色DNA区带时，用dH2O洗1次凝胶后，浸于停影液(冰醋酸25 ml，加水至500 ml)中约30分钟，然后把凝胶移至固定液(乙醇25 ml，冰醋酸2.5 ml加dH2O至500 ml)中固定。固定后的凝胶在看片灯上观察结果、拍照片，凝胶直接在激光扫描仪进行扫描。

，3者在第2外显子中有2个区域高度同源，3个基因分别表达各自独立的蛋白，它们的生理作用基本一致。研究表明，在许多肿瘤细胞中有Myc基因扩增或异常表达，但在不同的肿瘤组织和癌细胞系中，Myc基因家族的成员在扩增或表达方面有些差异。因此，深入研究Myc基因3个成员与人类肿瘤的关系非常有意义。本研究建立的PCR-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-激光扫描技术，可同时检测肿瘤组织中3种Myc基因的扩增情况，在肿瘤发生发展过程中，为进行3种基因各自作用机理的研究提供了简易的实验手段。