简介

结构

胶原蛋白的提纯

胶原蛋白的染色

简介

胶原纤维（collagenous fiber）胶原纤维在疏松结缔组织中排列成束，彼此交织吻合，纤维束常有分支。纤维具有韧性，抗牵引力强。电镜观察，胶原纤维由更细的微原纤维（microfibrils）组成。微原纤维有特殊的横带，其周期为64nm。每条微原纤维有一序列的明暗带。暗带中比明带有较多游离的化学根，所以贮留较多的电镜切片染色剂

胶原纤维：染成粉红色，束状，其中的原纤维大多看不清；

胶原纤维主要含有胶原蛋白，氨基酸有甘氨酸、脯氨和羟脯氨酸等。胶原是唯一含羟脯氨酸较多的蛋白质，因此，测定羟脯氨酸的量能确定组织中胶原的含量。胶原蛋白占全身蛋白质的30%。聚合成胶原的微原纤维的蛋白质分子称为原胶原分子 。胶原纤维是三种纤维中分布最广泛，含量最多的一种纤维。广泛分布于各脏器内。在皮肤、巩膜和肌腱最为丰富。胶原纤维染色主要用于和肌纤维的鉴别。

儿童时期，骨骼的胶元纤维占的比重较大，成骨细胞制造骨质十分活跃。因此，儿童的骨骼弹性大，不易折断。

结构

Ⅰ型胶原的原纤维平行排列成较粗大的束，成为光镜下可见的胶原纤维，抗张强度超过钢筋。其三股螺旋由二条α1（Ⅰ）链及一条α2（Ⅰ）链构成。每条α链约含1050个氨基酸残基，由重复的Gly-X-Y序列构成。X常为Pro（脯氨酸），Y常为羟脯氨酸或羟赖氨酸残基。重复的Gly-X-Y序列使α链卷曲为左手螺旋，每圈含3个氨基酸残基。三股这样的螺旋再相互盘绕成右手超螺旋，即原胶原。

原胶原分子间通过侧向共价交联，相互呈阶梯式有序排列聚合成直径50~200nm、长150nm至数微米的原纤维，在电镜下可见间隔67nm的横纹。胶原原纤维中的交联键是由侧向相邻的赖氨酸或羟赖氨酸残基氧化后所产生的两个醛基间进行缩合而形成的。

原胶原共价交联后成为具有抗张强度的不溶性胶原。胚胎及新生儿的胶原因缺乏分子间的交联而易于抽提。随年龄增长，交联日益增多，皮肤、血管及各种组织变得僵硬，成为老化的一个重要特征。

人α1（Ⅰ）链的基因含51个外显子，因而基因转录后的拼接十分复杂。翻译出的肽链称为前α链，其两端各具有一段不含Gly-X-Y序列的前肽。三条前α链的C端前肽借二硫键形成链间交联，使三条前α链“对齐”排列。然后从C端向N端形成三股螺旋结构。前肽部分则呈非螺旋卷曲。带有前肽的三股螺旋胶原分子称为前胶原（procollagen）。胶原变性后不能自然复性重新形成三股螺旋结构，原因是成熟胶原分子的肽链不含前肽，故而不能再进行“对齐”排列。

胶原蛋白的提纯

探索一个简要的胶原提纯方法，比较提取不同来源的胶原蛋白的物理化学特性，利用影像法探讨胶原纤维体外生长聚合三维构建过程和特征，为生物医学工程的生物材料设计和组织工程替代治疗提供基础。方法：利用乙酸法和酶的降解法提取猪脚关节韧带、大鼠尾的胶原蛋白，用光学显微镜定量化分析纤维聚集动力学以及结构特性，包括纤维密度、方向性融合。结果：组织和细胞中Ⅰ型胶原蛋白单分子是120kD，Ⅰ型胶原α1（Ⅰ）以及α2链表达在120、116kD，Ⅰ型胶原蛋白基质行成的胶原纤维状。结论：应用该修饰方法可提出并纯化到纯的胶原蛋白。第一次报道胶原基质成分在体外可形成三维结构并用黑白视野观察纤维形成特征；阳离子钾、钠、温度及pH影响纤维的强度和胶原的集结时间。

胶原蛋白的染色

胶原纤维在HE染色法被染成粉红色，除此之外，它还可以用一些阴离子的染料来进行染色，如用淡绿可把它们染为绿色，用甲苯胺蓝可将其染为蓝色，在网状纤维染色中，如不加以处理，它又可被染为棕黄色。常用的特殊染色法有Van Gieson.Masson和Mallary等方法。在免疫细胞化学染色中，胶原纤维由于含的负电荷过多，常导致某些非特异性的染色，应特别注意。

（一）.Van Gieson（V.G）染色法

I. 试剂的配制：

weigert氏苏木素

A液： 苏木素 1g （haematoxylin）

无水酒精 100ml

B液： 30%三氯化铁 4ml （ferric chloride）

蒸馏水 95ml

盐酸 1ml

II．Van Gieson氏液

A液： 酸性品红 1g（acid fuchsin）

蒸馏水　100ml

B液： 苦味酸饱和水溶液，（1.22%）（picric acid）

注意事项：

1、Weigert氏苏木素临用前取A液和B液等份混合，几个小时内用完，最长不得超过一天。

2、苏木素配后经二十多天才能成熟，必须提前配制。

3、该液能抵抗弱酸性染液，对已着染的细胞核在酸性染液的作用，不易被脱去颜色，如果不特别深染，则无须分化。

4、Van Gieson氏液取B液9ml，加入A液1ml，即可使用。

操作方法：（后面的各种方法，如没特别说明，都在室温下进行）

1、切片脱蜡至水，

2、用Weigert氏苏木素染20min，

3、水洗，必要时可分化，

4、流水冲洗10min，

5、染Van Gieson氏液1min，

6、用95%酒精快速分化，

7、无水酒精脱水，二甲苯透明，封固。

结果：

胶原纤维：鲜红色，肌纤维： 黄色，红细胞： 黄色，细胞核： 蓝黑或灰色。

注意事项：

1、该法染完的切片，较易褪色如需照相，应尽早完成。

2、苏木素染液如为棕色或沉淀，应将其抛弃。

3、分化用的酒精，应使用95%以上的酒精，低浓度的酒精褪色能力强，容易将着染的红色脱去。

4、切片也可以用天青兰苏木素替代Weigert氏苏木素，染核效果基本一样。

（二）.Masson氏三色染色法：天青石蓝液的配制：天青石蓝（Celestin blue B） 1.25g　硫酸铁铵（ferric ammonium sulfate）1.25g

蒸馏水 200ml

甘油（glycerin） 30ml

将前两者溶于蒸馏水中，然后煮沸，冷却后过滤，再加入甘油和麝香草酚。

Mayer氏苏木素的配制苏木素 0.1g　蒸馏水 100ml

钾明矾（Potassium alum） 5g

柠檬酸（Citric acid） 0.1g

水合氯醛（Chloral hydrate）20mg

配制法：

将苏木素放入蒸馏水中，用玻棒不停地搅拌直至完全溶解，再依次加入钾明矾，柠檬酸和水合氯醛，再继续搅拌，最后加入碘酸钠，搅拌均匀，即可使用。

丽春红酸性品红液的配制：　丽春红（ponceau 2R） 0.7g

酸性品红（acid fuchsin）0.3g

冰醋酸 1ml

蒸馏水 99ml

操作方法：　1

、切片脱蜡至水，　2、1%高锰酸钾氧化切片5min，

3、水洗，草酸漂白1min，

4、水洗，蒸馏水洗，天青石蓝染5min水洗，

5、摔去余液不用水洗，滴染Mayer氏苏木素3-5min，

6、流水冲洗5-10min，

7、丽春红苦味酸饱和液染5min，

8、1%醋酸水溶液洗，

9、1%磷钼酸分化切片约5min，

10、蒸馏水洗，

11、1%淡绿或者甲苯胺蓝滴染30s，

12、1%醋酸水溶液洗切片，

13、95%酒精分化，无水酒精脱水，

14、二甲苯透明，中性树胶封固。

结果：　胶原纤维呈现绿色或蓝色，细胞核呈现灰黑或灰蓝色，肌肉和胞质红细胞呈现红色。

注意事项：①Masson氏染液配完后保存时间不宜过长，如有可能，每次染色以染配为佳，如何可使着色颜色的鲜艳性。②切片在各级酒精中脱水，时间不宜过长，否则会将着染的颜色脱去。③切片保存所着染的颜色显长为1—2年以后会随着时间的延长而逐渐褪去，应予注意。④磷钼酸和磷钨酸在染色法中的作用各有不同，磷钼酸作用于胶原纤维，磷钨酸作用于纤维胶]质，肌胶质，神经胶质和上皮纤维等。上述两种试剂的使用，可以促进组织有选择的染色，它们可以减少背景和核的染色，使背景清晰。⑤　如有可能，在组织固定时，用Zenker氏固定液固定，如此对染色效果将更好。

临床应用：　1

、与淀粉样物的区别： 胶原纤维发生病变如坏死或透明变性时，它与淀粉样物在HE染色时被染为粉红色，不好区别。应用V.G染色法，能将胶原纤维染为粉红色，而淀粉样物将被染为黄色。　2、应用与间胚叶来源肿瘤的区别：

如纤维瘤（肉瘤），平滑肌、横纹肌瘤（肉瘤），神经纤维瘤（肉瘤）、恶性纤维组织细胞瘤等，由于都含有大量的纤维，HE染色均为红色。应用Masson氏染色法，可将胶原纤维染色蓝色或绿色，肌源性组织被染为红色。

3、应用与其他慢性炎症的区别。

如慢性阑尾炎，疤痕愈合时，纤维愈复病灶可被染为鲜红色或蓝绿色，SARS病患者愈合后有的肺部可出现疤痕，粘连，此时可显示蓝色或绿色。

可用于鉴定肝硬化及创伤组织的修复程度。肝硬化时的肝组织有许多不同大小的假小叶，用上述方法显示时，可显示出不同的组织结构。V.G法可将包绕假小叶的胶原纤维染成红色，胆汗呈绿色。

小结

胶原纤维在上述的两种方法中着染不同的颜色，如V.G着染红色，Masson氏着染蓝色或绿色。这主要取决于染料对组织的渗透、吸附、沉淀和反应，而染料分子量的大小是关键，分子量小的分子移动迅速，行动快，对组织的渗透性较强，能穿透较为致密的组织。分子量大的染料分子移动较迟缓，渗透力较弱，可作用于组织强求构较疏松的组织，染色时间可适当延长。

在相关的染料中，分子量从小到大依次排列是：苦味酸（黄色）：229.11；桔黄G（黄色）：452；丽春红（红色）：480.42；酸性品红（红色）：585.53；苯胺蓝（蓝色）：737.72；亮绿（绿色）：792.72；甲基蓝（蓝色）>99。

染色是一个较为复杂的化学反应和物理作用的双重过程，在应用这些方法时，根据不同情况，选择不同的方法，认真地操作，方能获得最佳的效果。