核糖核酸酶 P 是一种核糖核蛋白, 含有一个单链RNA分子, 长度为375个碱基, 结合一个相对分子质量为20kDa的多肽(119个氨基酸残基)。RNA具有催化切割tRNA的能力,蛋白质则起间接的作用,可能是维持RNA结构的稳定。该酶广泛存在于原核生物和真核生物(核仁、叶绿体和线粒体)中，也参与核糖体RNA的加工。

核糖核酸酶 P的发现故事

核糖核酸酶P突破性进展

应用人胎肝细胞研究核糖核酸酶P的M1-RNA

应用Daudi细胞研究核糖核酸酶P的M1-RNA

应用Jurkat细胞研究核糖核酸酶P的M1-RNA

关于核糖核酸酶P的技术

核糖核酸酶 P的发现故事

托马斯·罗伯特·切赫(Thomas Robert Cech)

1947年生于美国。格里内尔大学毕业后，在加利福尼亚大学的柏克莱分校获得博士学位。1983年任科罗拉多大学教授。他在研究四膜虫的rRNA的成熟体结构中，发现了可以自我拼接的RNA的催化作用（核糖核苷酸酶）。1989年获诺贝尔化学奖。

“如果你是一个不为常识所束缚的人，那么，你有可能获诺贝尔奖。”

第二次留学结束后，我刚一回国就听说了切赫博士的名字，因为他发现了RNA（核糖核酸）具有酶的催化作用。

切赫生于芝加哥。大学毕业后，他到美国国家卫生研究院（NIH）工作。我恰好在那里留学。他主要研究原生动物四膜虫的核蛋白体核糖核酸（rRNA）基因。

顺便说一下，四膜虫是我们当时的研究材料。我们抽取四膜虫的tRNA（转移核糖核酸），了解其构造和机能。四膜虫虽然是单细胞，但它又不同于细菌，而是和人一样的真核生物。对那些想要了解人类的人来说，四膜虫是一种非常好的实验材料。

真核生物的基因是由遗传信息部分和非遗传信息部分组成的。在两者都被转录成前体mRNA（信使RNA）后，除去非信息部分，成为只含有信息部分的成熟mRNA，最后，在成熟的mRNA基础上合成蛋白质。rRNA的情况也是如此，基因中包括非信息部分在内，先合成前体rRNA，然后除去非信息部分，成为成熟的rRNA。

切赫的努力目标是找出从前体去除非信息部分并且使前体成为成熟体的那个酶。结果他发现，在含有嘌呤核苷和镁离子的溶液中，无论加上哪一种蛋白提取液，都能转变为成熟体。甚至在不添加对照用的标准蛋白提取液的情况下，也能变成成熟的RNA。

试验样品与对照样品如果没有差别，一般说实验就失败了，但是切赫并不认为是失败，而是坦然地接受了这个结果。他认为，不添加蛋白提取液也能使前体变成成熟体，证明RNA本身具有一种催化能力。

这个结论是对常识的一种否定。通常认为生物体的催化作用是依靠酶来完成的，而酶全部是蛋白质。提出这种理论是需要勇气的。他发表了论文，宣布自己发现了一种本身带有催化作用的RNA，但是没有人相信他。

后来，奥尔特曼博士通过实验显示了使前体tRNA变成成熟体tRNA的酶——核糖核酸酶P的活性是混在RNA中的，蛋白质部分没有这种活性。有关学会在新的事实面前终于承认了RNA的催化功能。于是，1989年切赫和奥尔特曼一起获诺贝尔化学奖。

切赫为什么能发现RNA的催化作用并且获诺贝尔奖呢？

大概是因为他对自己的实验很有信心吧，即使得出与常识完全相反的结果。比起常识，他更相信实验结果。

大多数人在学习了前人发现的法则、原理或者方法论以后，都可以灵活运用，从事研究；然而不知不觉中却为这些既定的知识和观念所束缚。他们只在前人圈定的范围内从事实验，只在既定知识框架内进行思考。实际上，前人发现的法则、原理或者方法论往往只在某种范围内通用，这一点务必铭记在心。如果立足于我们人类对自然界的理解只是极为有限的一部分，坦然地接受实验结果，那么，我们的想象力就如同插上了可以自由翱翔的翅膀。

发现了用常识解释不通的、具有酶功能的RNA，获诺贝尔奖。

西德尼·奥尔特曼(Sidney Altman)

1939年生于加拿大。科罗拉多大学毕业后，在加利福尼亚大学取得博士学位。1980年起任耶鲁大学教授。在研究细菌tRNA的合成中，发现RNA具有催化作用，为此，1989年获诺贝尔化学奖。

“如果你能根据别人刚刚发表的成果马上修正自己的研究工作，那么，你有可能获诺贝尔奖。”

知道奥尔特曼博士的名字要比切赫博士早得多。我第一次留学回国后，在板桥的研究所就听说过他的名字。

他出生在加拿大，科罗拉多大学毕业，1971年发现了可以切断tRNA（转移核糖核酸）前体的酶——核糖核酸酶P。起初他认为，要显示核糖核酸酶P在体内的切断活性是离不开RNA（核糖核酸）成分和蛋白质成分的。

一天，他听说切赫关于四膜虫的rRNA（核蛋白体核糖核酸）前体依靠rRNA本身的催化作用变成了成熟体的报告，马上更新检查自己的核糖核酸酶P的RNA成分和蛋白质成分的机能。他想，tRNA和rRNA有区别，但是两者都是靠酶的催化才从RNA的前体变成成熟体的。

结果，他发现核糖核酸酶P在RNA成分中的正确位置上切断了前体tRNA，而蛋白质成分中则没有这种切断活性。

切赫的rRNA是自身切断自身，然后进行拼接的分子内的自我催化，还不能绝对说是酶。而核糖核酸酶P催化的不是自己，而是催化别的分子的tRNA，使之成熟，所以应该认为是酶。他发表了RNA具有酶催化作用的论文。

这以后，他又陆续查明，不仅tRNA、rRNA，而且mRNA也是靠RNA的催化作用成为成熟的RNA的。1989年，他和切赫一起获诺贝尔化学奖。

其实，奥尔特曼1971年就已经分离出有可能获奖的RNA的酶了，只是连他自己在内，谁都没有意识到这一点。若与切赫的发现比较，切赫的发现甚至可称是再发现。像孟德尔等科学家那样，虽有重大发现但当时得不到社会的承认，日后他人再重新发现的现象时有发生。但是，像这种本人没有发现其重要性，日后从他人的工作中得到启发再由本人重新发现的例子却非常少。

将别人的研究成果当作摹本，重新检查自己的研究成果，拂去灰尘，获诺贝尔奖。

核糖核酸酶P突破性进展

来自美国科罗拉多州大学分子，细胞和发育生物学系，以及亚利桑那州立大学生命科学学院化学与生物化学系的研究人员通 过比较真核与细菌核糖核酸酶P RNA（Ribonuclease P RNA，RNase P)的不同，获得了一RNase P三级结构，为研究RNase P带来了突破性进展，这一研究成果公布在新鲜出炉的《Molecular Cell》（11月3日）杂志封面上。

核糖核酸酶P（RNase P）是负责tRNA前体5＇端成熟的酶，它由蛋白质和RNA两种亚单位组成。1983年Altaman等人报道，在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，RNase P中的 RNA能够切割tRNA前体5＇端。而Rnase P中的蛋白组分没有催化功能，只是起稳定构想的作用。这是首次报道的具有反式切割作用的RNA分子。由于他们具有类似核糖核酸酶功能，而化学本质为核酸，因此被切赫称之为核酶。鉴于切赫在此领域作出的卓越贡献，因而获得1988年诺贝尔化学奖。

在之后的研究中陆续发现，细菌和真核的RNase P RNA有相同的起源祖先，但是却沿着不同的进化道路有了分化：真核的RNase P RNA在没有蛋白的存在的时候是不具有催化功能的，细菌的RNA则相反——没有蛋白也同样可以催化底物。

通过比较这两种不同的RNA，研究人员逐渐清楚了解了这个RNA和蛋白结合世界的转换，他们发现虽然真核生物RNAs不能单独催化底物，但是即使在没有蛋白的存在下，也可以折叠成有功能的形式，并结合到tRNA上去。基于这些交联反应结果和细菌RNAs的晶体结构，研究人员得到了一种真核RNase P RNA三级结构模型，这种RNA包含一个核心的与细菌RNA相似的结构，但是这个结构没有细菌RNAs催化的特征和三级结构的稳定性。

应用人胎肝细胞研究核糖核酸酶P的M1-RNA

研究抗组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)核糖核酸酶P(RNaseP)抑制肝细胞表面MHCⅡ分子的表达。

方法 ：M1—RNA是RNaseP的催化活性单位，设计并克隆针对CⅡTA第629位点的M1—RNA(M1—629—GS)及其对应的CⅡTA靶序列，分别插入腺相关病毒载体psNAV(psNAV—M1—629—GS)及pGEM—7zf(+)载体(pGEM—629)，进行体外转录和切割反应鉴定其活性。通过纳米载体介导psNAVM1—629—Gs稳定转染人胎肝细胞，流式细胞术检测MHCⅡ类抗原表达，逆转录聚合酶链反应检测CⅡTA mRNA水平。

结果 ：M1—629—GS与pGEM—800体外切割产物电泳见预期切割条带(553nt和176nt)。psNAVM1—629—GS^+肝细胞表面人白细胞抗原(HLA)—DR、DP、DQ的诱导型表达分别为(1．01±0．51)％、(4．37±1．28)％、(1．98±0．42)％，对照组psNAVM1—452—GS^+分别为(10．81±3．09)％、(40．12±2．60)％、(5．71±0．11)％，两组比较分别下调90．65％、89．11％及65．32％．；psNAV—M1—629—GS^+克隆诱导型CⅡTA mRNA与β—actin比值为0．94±0．25，空载体组比值为2．30±0．49，M1—629—GS可明显下调CⅡTA mRNA含量(t=5．56，P<0．01)。

结论 ：抗CⅡTA RNaseP—M1—629—GS可发展为新一代抗肝移植排斥的核酸药物。

应用Daudi细胞研究核糖核酸酶P的M1-RNA

探讨抗MHC-Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)的核糖核酸酶P对Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达的抑制作用.

M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位.以pTK117质粒为模板,PCR扩增带有抗CⅡTA第452及629位点的引导序列的M1-RNA(M1-452-GS及M1-629-GS),再分别插入pUC19载体(pUC19-M1-452-GS 和 pUC19-M1-629-GS).从Raji细胞中克隆CⅡTA基因DNA片段(114～800)后插入pGEM-7zf(+)质粒.将重组M1-RNA与靶基因的mRNA进行细胞外共孵育,显示仅pUC19-M1-629-GS可特异性地切割靶基因mRNA.再将M1-629-GS克隆入psNAV载体(pA629)并稳定转染Daudi细胞株,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平,流式细胞术检测其HLA-DR、DP、DQ抗原表达.与对照组比较,M1-629-GS阳性Daudi细胞的CⅡTA mRNA含量减少90.19﹪(P＜0.05),其HLA-DR、DP、DQ抗原表达分别降低91.97﹪、90.19﹪、92.36﹪(P＜0.05).

研究表明,抗CⅡTA的核糖核酸酶P可通过抑制CⅡTA的转录而降低Daudi细胞表面的MHC-Ⅱ类分子的表达.

应用Jurkat细胞研究核糖核酸酶P的M1-RNA

探讨抗MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)的M1-RNA抑制细胞表面MHCⅡ类分子的表达.

M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CⅡTA第3408位点的M1-RNA(M1-3408-GS)及其相应的CⅡTA靶基因片段(3176-3560),分别插入pUC19、pGEM-7zf(+)载体,进行细胞外切割活性筛选.将细胞外切割作用明显的M1-3408-GS亚克隆入psNAV载体并稳定转染Jurkat细胞株,采用流式细胞术检测该细胞表面经典的MHCⅡ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平.

结果表明:在重组人干扰素(IFN)-γ诱导下,M1-3408-GS阳性Jurkat细胞株与对照组比较,其表面HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ抗原诱导型表达分别降低了83.17﹪、94.12﹪及84.31﹪;同时CⅡTA的mRNA含量明显降低(P＜0.05,t=4.89).结论:抗CⅡTA的M1-RNA(M1-3408-GS)降低了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达.

his study was purposed to investigate the inhibitory effect of anti-CⅡTA M1-RNA on MHCⅡ expression. The M1-RNA with guide sequences (GS) recognizing CⅡTA at 3408 site (M1-3408-GS) and CⅡTA target RNA (3176-3560) were constructed, then cloned into the pUC19 and pGEM-7zf(+) vector respectively. The recombinant M1-RNA and its target RNA were incubated in cell-free conditions. It showed that M1-3408-GS could exclusively cleave target RNA, then it was cloned into the psNAV vector. Stable transfectants of Jurkat cells with M1-3408-GS were analyzed for classical MHCⅡ (HLA-DR, -DP, -DQ) induction in response to IFN-γ by flow cytometry. The level of CⅡTA mRNA was measured by RT-PCR. The results showed that after IFN-γ treatment, the expression of HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ on M1-3408-GS positive Jurkat cells decreased 83.17%, 94.12% and 84.31% respectively as compared with control. At the same time the mRNA contents of CⅡTA also markedly decreased (P<0.05, t=4.89). It is concluded that anti-CⅡTA M1-RNA (M1-3408-GS) inhibits CⅡTA, decreases itself mRNA content and so suppresses expression of MHCⅡ molecules regulated by CⅡTA.

关于核糖核酸酶P的技术

申请专利号： CN94112572.6

专利申请日 ：1994.10.19

名称 ：一种由核糖核酸连续酶水解制5'一核苷酸的方法

公开（公告）号： CN1121112

公开（公告）日： 1996.04.24

类别 ：化学；冶金

申请（专利权）： 中国科学院大连化学物理研究所

地址 ：116012辽宁省大连市中山路161号

发明（设计）人： 邵晶平; 郭春香; 刘宇新; 郭和天

专利代理机构： 中国科学院沈阳专利事务所

代理人 ：张晨

摘要 ：一种由核糖核酸连续酶水解制５′－核苷酸的方法，其特征在于：将核酸酶首先注入超滤膜反应器；再连续泵入ＲＮＡ缓冲液，保持温度６０～７０℃，泵入速度０．５～１．５ｍｌ／ｍｉｎ；收集渗透液并经分离、浓缩、结晶，得到５′－核苷酸产品。本发明能连续生产，操作方便，成本低，水解率高。

主权项：

一种由核糖核酸连续酶水解制５′－核苷酸的方法，其特征在于：在水解过程中使用了超滤膜反应器，工艺过程如下：－－将核酸酶Ｐ↓［１］注入膜反应器（５）的反应腔中，其中核酸酶Ｐ↓［１］的浓度为１００～１０，０００μ／ｍｌ，反应器的膜采用聚砜超滤膜，膜截留分子量为５０００～１０，０００；－－保持膜反应器（５）温度在６０～７０℃，并连续泵入浓度为１～１０％的ＲＮＡ酯酸缓冲液，其ＰＨ＝５．０～６．０，缓冲液中还含有０．０１～０．１ｍＭ的ＺｎＳＯ↓［４］，泵入速度在０．５～１．５ｍｌ／ｍｉｎ之间；－－收集渗透液分离、浓缩、结晶，最终得到５′－胞苷酸，５′－鸟苷酸，５′－腺苷酸和５′－尿苷酸。