HE染色介绍

染色分类

染色结果

常规HE染色步骤(试剂配置 染色流程)

HE染色介绍

苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，简称HE染色法 ，石蜡切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染液为碱性 ，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料 ，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。

染色分类

易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia )；而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性（neutrophilia)。

组织内的蛋白质构成蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。

去氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红是细胞浆的良好染料。

由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。经苏木精染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，如处理适宜，可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。故各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。

染色结果

细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。

着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。

常规HE染色步骤

试剂配置

A：0.5~1% 的伊红酒精溶液：

称取伊红Y 0.5~1 g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。

B：苏木素染液配方：(配制3000 ml，可按比列减少)

苏木精 6 g

无水乙醇 100 ml

硫酸铝钾 150 g

蒸馏水 2000 ml

碘酸钠 1.2 g

冰醋酸 120 ml

甘油 900 ml

配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。

染色流程

(1)二甲苯（Ⅰ） 15min

(2) 二甲苯（Ⅱ） 15 min

(3)100%乙醇（Ⅰ） 5min

(4)100%乙醇（Ⅱ） 5 min

(5)80%乙醇 5min

(6)蒸馏水 5 min

(7)苏木精液染色 5 min

(8 ) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s

(9) 1%盐酸乙醇 1-3 s

(10) 稍水洗 10-30 s

(13)蒸馏水过洗 1-2 s

(14) 0.5%伊红液染色 1-3 min

(15) 蒸馏水稍洗 1-2 s

(16) 80%乙醇稍洗 1-2 s

(17) 95%乙醇（Ⅰ） 2-3 s

(18) 95%乙醇（Ⅱ） 3-5 s

(19) 无水乙醇 5-10 min

(20) 石炭酸二甲苯 5-10 min

(21) 二甲苯（Ⅰ） 2 min

(22) 二甲苯（Ⅱ） 2 min

(23) 二甲苯（Ⅲ） 2 min

(24) 中性树胶封固

注：①第（10）、（11）步可省去，（12）步冲水时间需延长至20-30min。

②第（20）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

* 冷冻切片HE染色步骤：

（1）冰冻切片固定 10～30 s

（2）稍水洗 1～2 s

（3）苏木精液染色（60℃） 30～60 s

（4）流水洗去苏木精液 5～10 s

（5）1%盐酸乙醇 1～3 s

（6）稍水洗 1～2 s

（7）促蓝液返蓝 5～10 s

（8）流水冲洗 15～30 s

（9）0.5%曙红液染色 30～60 s

（10）蒸馏水稍洗 1～2 s

（11）80%乙醇 1～2 s

（12）95%乙醇 1～2 s

（13）无水乙醇 1～2 s

（14）石炭酸二甲苯 2～3 s

（15）二甲苯（Ⅰ） 2～3 s

（16）二甲苯（Ⅱ） 2～3 s

（17）中性树胶封固。

注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

染色结果：细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。

4．12 切片脱水透明 切片经HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。切片1-2级无水乙醇脱水，也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。石碳酸有较强脱水能力，但长时间可使切片脱色，因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。