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又称第二类定位基，间位定位基，致钝基团。当苯环上连有这类取代基时，新进入苯环的取代基主要进入它的间位（大于40%），使得苯环上发生亲电取代反应比苯困难的原子或原子团。属于间位定位基的有：（最强）-NH3+,-NR3+（氨基正离子）-NO2,-CF3,-CCl3,-CN,-SO3H,甲酰基，酰基，羧基，酯基等。

这类定位基在结构上往往具有以下特点：他们与苯环直接连接的原子，几乎都以不饱和键和电负性较强的其他原子相连，或定位基本身带有正电荷。