DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 dna序列分析的主流。美国pe abi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是abi prism 310型dna测序仪的测序原理和操作规程。

原理

试剂与器材

操作步骤(1．pcr测序反应 2．醋酸钠/乙醇法纯化pcr产物 3．电泳前测序pcr产物的处理。 4.分析或打印出彩色测序图谱 5．序列分析 6.处理仪器)

计算

注意事项与评价

DNA测序技术-发展历史

原理

abi prism 310型基因分析仪(即dna测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddntp(标记终止物法)，因此通过单引物pcr测序反应，生成的pcr产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链dna混合物，使得四种荧光染料的测序 pcr产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的ccd(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在ccd摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为dna序列，从而达到dna测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定dna片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。pe公司还提供凝胶高分子聚合物，包括dna测序胶(pop 6)和genescan胶(pop 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的ccd摄影机检测器，使dna测序缩短至2.5h，pcr片段大小分析和定量分析为 10～40min。

由于该仪器具有dna测序，pcr片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行dna测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(sscp)、微卫星序列分析、长片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析，临床上可除进行常规dna测序外，还可进行单核苷酸多态性(snp)分析、基因突变检测、hla配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。

试剂与器材

1．bigdye测序反应试剂盒 主要试剂是bigdye mix，内含pe专利四色荧光标记的ddntp和普通dntp，amplitaq dna polymerase fs，反应缓冲液等。

2．pgem-3zf (+) 双链dna对照模板 0.2g/l，试剂盒配套试剂。

3．m13(-21)引物 tgtaaaacgacggccagt，3.2μmol/l，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。

4．dna测序模板 可以是pcr产物、单链dna和质粒dna等。模板浓度应调整在pcr反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒dna，浓度为0.2g/l，即200ng/μl。

5．引物 需根据所要测定的dna片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/l，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如m13(-21)引物，t7引物等。

6．灭菌去离子水或三蒸水。

7．0.2ml或和0.5ml的pcr管 盖体分离，pe公司产品。

8．3mol/l 醋酸钠(ph5.2) 称取40.8g naac·3h2o溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调ph至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。

9．70%乙醇和无水乙醇。

10．naac/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/l naac混匀，室温可保存1年。

11．pop 6测序胶 abi产品。

12．模板抑制试剂(tsr) abi产品。

13．10×电泳缓冲液 abi产品。

14．abi prism 310型全自动dna测序仪。

15．2400型或9600型pcr仪。

16．台式冷冻高速离心机。

17．台式高速离心机或袖珍离心机。

操作步骤

1．pcr测序反应

(1) 取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：

所加试剂 测定模板管 标准对照管

bigdye mix 1μl 1μl

待测的质粒dna 1μl －

pgem-3zf (+) 双链dna － 1μl

待测dna的正向引物 1μl －

m13(-21)引物 － 1μl

灭菌去离子水 2μl 2μl

总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2) 将pcr管置于9600或2400型pcr仪上进行扩增。98℃变性2min后进行pcr循环，pcr循环参数为96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。

2．醋酸钠/乙醇法纯化pcr产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。

(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。

(3) 加70%(v/v)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。

3．电泳前测序pcr产物的处理。

(1) 加入12μl的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。

(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。

(3) 在pcr仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，待上机。

4.分析或打印出彩色测序图谱

上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kv预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kv，20min)，在7.5kv下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。

5．序列分析

仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.处理仪器

测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

计算

测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括n数)/650×100%

差异碱基即测定的dna序列与已知标准dna序列比较不同的碱基，n为仪器不能辨读的碱基。

注意事项与评价

1．abi prism 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。

2．本实验测序pcr反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以pcr管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧pcr管盖外，最好选用pe公司的pcr管。如pcr结束后pcr液小于4～4.5μl，则此pcr反应可能失败，不必进行纯化和上样。

3．作为测序用户来说，只需提供纯化好的dna样品和引物，一个测序pcr反应使用的模板不同，需要的dna量也就不同，pcr测序所需模板的量较少，一般pcr产物需30～90ng，单链dna需50～100ng，双链dna需200～500ng，dna的纯度一般是a260nm/a280nm为 1.6～2.0，最好用去离子水或三蒸水溶解dna，不用te缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。

4．本实验使用的测序试剂盒是bigdye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测dna长度为650bp左右。本仪器dna测序精确度为 (98.5±0.5) %，仪器不能辨读的碱基n＜2%，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于n碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对

DNA测序技术-发展历史

70年代末，WalterGilbert发明化学法、FrederickSanger发明双脱氧终止法手动测序，同位素标记

80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，计算机图象识别

90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳

2001年完成人类基因组框架图