建立跳跃文库历经二次限制性内切酶切割与载体重组。先将染色体的DNA用识别序列长的限制性内切酶切割成较大的片段，与载体连接克隆。对克隆的基因再次酶切，这次酶切片段小，再次和质粒重组，获得中间夹着第一次克隆的质粒，两端仅连有小片段的基因组DNA的重组克隆，由此获得的DNA文库即跳跃基因组文库。因为此时的第一次重组而且位于中间的质粒两侧的基因组原本在染色体中实际上不仅不相临，而且至少有百万碱基距离的间隔。