药物介绍

基本信息

采用原理

分析原理

实验所需仪器

检测方法

操作者应该注意之事项

样品处理

灵敏度

特异性

回收率

试剂变质的迹象

操作者应该注意之事项

药物介绍

b－克仑特罗（clenbuterol，CLE）是一种肾上腺受体激动剂即神经兴奋剂。此类药品在临床上用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等疾病，因此药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。其残留量可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对消费者的健康极有危害。现已被明令禁止用于养殖业。HPLC或GC-MS一直用作检测β兴奋剂的方法，但是其前处理步骤费用昂贵。酶联免疫检测试剂盒则可经济、快速地检测尿，肌肉，肝脏及饲料中的CLE。

基本信息

【中文名称】：克仑特罗

【简写拼音】：KLTL

【英文名称】：Clenbuterol

【所属类别】：平喘药\\β肾上腺素受体激动剂

采用原理

化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

分析原理

在化学发光板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的氯霉素与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素药物的抗体，加入酶标二抗后，再加入底物用光子计数仪测定各孔的光子计数，光子计数的强度随氯霉素浓度的升高而逐渐下降，成良好的负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中氯霉素类药物的残留量。

实验所需仪器

（1）微孔板酶标仪450nm/630nm

（2）旋转蒸发仪/氮气吹干装置

（3）均质器

（4）振荡器

（5）涡旋仪

（6）离心机

检测方法

试剂盒组成

1、微量测试孔：每条8孔，每板12条

2、克伦特罗标准溶液：

0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05 ppb，1.5ml/瓶

3、96孔化学发光板×1块 （包被有偶联抗原）

4、高浓度标准品：（1ml/瓶）1ppm

5、酶标记抗体

6、显色剂

7、终止液

8、20×浓缩洗涤液

9、2×浓缩复溶液

操作者应该注意之事项

…反应停止液为1M硫酸，避免接触皮肤

…不要使用过了有效日期的克伦特罗测定试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低

…不要交换使用不同批号的盒中试剂

使用说明

A、注意事项

1、使用前先将克伦特罗标准溶液6瓶，浓缩萃取稀释液，浓缩洗涤液，酶标记物，底物溶液及微量测试孔条置于室温下，回温30分钟。

2、洗涤工作液

用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释　3、回温后，取出所需微量测试孔条，将剩余板条立即放回铝箔袋中用胶带封好，置于4o℃保存。

样品处理

尿液：离心

组织：用柱层析法预纯化。

饲料：酸化，中和离心。

样品处理需要的时间：（10个样品）

饲料……………………………60分钟

尿液……………………………10分钟

组织……………………………6小时

测试时间： 约1小时

8.1尿样以2500转离心10分钟后取上清部分（清亮部分）用于检测。若尿样呈浑浊状，需先用滤纸过滤，否则会影响测定数值。本试剂盒的标准曲线及计算（采用曲线定量）, 与德国Bio-pharm公司一致。反应体系加液量为20μl样品: 100μl酶液。（见第4页尿样快速检测程序）。

8.2.1带有低脂肪的肝，肉，或组织

…5g粉碎的样品与25ml 50mM HCL 混合，振荡1.5小时，匀浆。

…称6g匀浆物（相当于1g肝脏），加入离心管中。

…10-15℃以4000转/分或更高速，离心15分钟

…转移上清液到另一个离心管中，加300μl 1MNaOH 混合15分钟。

…加入4ml 500mM磷酸二氢钾缓冲液（pH3.0），简单的混合后放置4℃至少1.5小时或过夜。

…10-15℃以4000转/分或更高速，离心15分钟。分离全部上清液（应该是清亮的），使其升至室温（20-25℃），然后用C18柱纯化（见C18柱纯化步骤）。

8.2.2 肉和组织

…5g 粉碎的样品与25ml50mM Tris 缓冲液pH8.5混合，振荡0.5小时，匀浆。

…加入15ml庚烷（n-heptane）振荡5分钟除去脂肪。

…4000g或更高的速度10-15℃离心5分钟

…用巴斯德吸管除去上面的庚烷层及中间薄薄的脂肪层

…再用15ml庚烷（n-heptane）重复步骤2-4

…向匀浆的肉液中加入0.5ml半浓的盐酸，振荡1小时

…称6g均质物（相当于1g肝脏），加入离心管中。

…以下从8.2.1的第一个离心步骤开始，像处理肝脏一样继续进行处理。

C18柱以下列方式纯化

所有试剂和样品处理必须在室温条件下（20-25℃）并严格控制过柱时的流速。

…用3ml甲醇（100%）洗涤柱子，流速为1滴/每秒

…用2ml洗涤液洗涤柱子（50mM磷酸二氢钾缓冲液pH3.0）

…样品进柱（肝，肉，或组织的全部上清液）

…用2ml洗涤液洗涤柱子（50mM磷酸二氢钾缓冲液pH3.0）

…用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2分钟干燥柱子

…用2ml甲醇（100%）洗脱样品，流速为15滴/分钟

…在50-60℃并且在弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂

…用1ml蒸流水溶解干燥的残留物，取50μl进行分析

注意：

样品的保存

…未处理的样品冷冻保存

…HCL匀浆后的样品在2-8℃稳定3天

…以磷酸二氢钾缓冲液提取后的样品（C18柱纯化之前）在2-8℃稳定2天，使用前需离心。

…C18柱纯化步骤6所获得的甲醇洗脱物可以冷冻保存数周，在2-8℃稳定2周。

…用蒸馏水溶解的干燥残留物（步骤8）在2-8℃稳定1周。

C、操作步骤

本产品的酶标记物与克伦特罗标准溶液均直接使用，无需再稀释。

1、于适当微孔中分别加入100mL标准溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。

2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前处理的样品溶液。

3、再于每一微孔中另再加入50mL酶标记物。

4、轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温下避光静置温育1小时。

5、将微孔中的反应液甩掉，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗3次。

6、最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，轻敲盘子四周，使其充分混合。

8、于室温下避光静置温育20分钟。

9、于每一微孔中加入100mL反应终止液。

10、用化学发光仪于下判读。

D、判定

1. 计算B/B0值。用样品或标准液吸光度值(B)除以零标准吸光度值(B0)再乘以100%。

2. 以B/B0值为纵坐标，以标样浓度的对数值为横坐标，做标准半对数曲线。

3. 根据每个样品的B/B0值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。

4. 由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。

H、再现性

针对克伦特罗检测试剂盒精密度测试，重复6次，所得不同浓度标准溶液的吸光值变异系数(%CV).

灵敏度

克伦特罗测定试剂盒的平均检测下限约为0.05ng/g（0.05ppb）。

特异性

与克伦特罗类似物的交叉反应：

克伦特罗(Clenbuterol) 100%

特布他林Terbutalin 4%

沙丁胺醇Salbutamol 11%

异丙肾上腺素Isoproterenol <2%

肾上腺素Adrenalin <2%

去甲肾上腺素Noradrenalin <2%

回收率

回收率为90%±15%

试剂变质的迹象

发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之，0标准液的A450nm<0.6时，表示试剂可能变质。

操作者应该注意之事项

…反应停止液为1M硫酸，避免接触皮肤

…不要使用过了有效日期的克伦特罗测定试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低

…不要交换使用不同批号的盒中试剂