二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的BCA　Solution　A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

测定方法：

实验试剂

(1) BCA试剂的配制

① 试剂A，1L：分别称取10g BCA (1%)，20g Na2CO3·H2O(2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3(0.95) ，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。

②试剂B，50ml：取2g CuSO4·5H2O (4%)，加蒸馏水至50ml。

③BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。

(2)标准蛋白质溶液：称取0.5g牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成5mg/ml的溶液。用时稀释十倍。

实验操作

绘制标准曲线：

取96孔酶标板，按下表加入试剂。

管号　1　2　3　4　5　6　7　8

标准蛋白溶液（μl）蒸馏水（μl）
BCA试剂（μl）
蛋白质浓度（mg/ml）　0
20
200
0　1
19
200
0.025　2
18
200
0.05　4
16
200
0.1　8
12
200
0.2　16
4
200
0.3　18
2
200
0.45　20
0
200
0.5

上述试剂加完后，准确吸取20μl样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μl，轻摇，于37℃保温30-60min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上590nm处比色，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。