简介

干细胞复苏的主要操作过程

在干细胞复苏操作中应注意问题

干细胞复苏后存活率的计算

简介

在干细胞的实验操作中，冻存的干细胞要进行复苏，再培养传代，这一技术称为干细胞复苏。冷冻的干细胞活化原则为快速解冻，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，以避免冰晶重新结晶而对干细胞造成伤害导致干细胞的死亡。干细胞复苏时常用的保护剂有二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透干细胞。干细胞活化后约需数日，或续代一至二代，其细胞生长和特性才会表现正常。干细胞成功复苏后对其活力的影响不大。

干细胞复苏的主要操作过程

1. 从液氮罐中取出冻存管。（有时因冻存管未封严，浸入了液氮，取出后因冻存管内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。）

2. 迅速放入盛有 36℃～37℃水的恒温水浴锅中，并不时摇动，尽快解冻。

3. 剪开纱布口袋，取出冻存管，用75%酒精擦拭消毒后，在超净台中打开冻存管，用吸管吸出干细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使干细胞悬浮。

4. 低速离心（500～1000rpm）5～10min，弃去上清液后再重复2次用培养液漂洗、离心。

5. 加入培养液适当稀释后，再装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。

在干细胞复苏操作中应注意问题

1. 自液氮取出冻存管后，首先要检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松动。

2. 一管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，干细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

3. 加培养基的量和DMSO的浓度有关，如果加入培养基量过少，相对DMSO的浓度就会较大，从而影响干细胞生长，DMSO的浓度在小于0.5%-1%的时候对一般干细胞没有影响。所以若冻存液DMSO浓度为10%，需加10ml以上的培养基才恰好稀释至无害浓度。

干细胞复苏后存活率的计算

取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率：

存活率=（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100%