细胞膜电位荧光探针

钙离子荧光探针FLUO-3AM应用详解(一、Fluo-3AM的理化性质 二、Fluo-3AM的工作原理 三、Fluo-3AM的应用)

使用说明：(2. 悬浮细胞 . 组织切片 原理：)

荧光显微镜复染方法：

细胞膜电位荧光探针

DiBAC4(3)是一种细胞膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料，DIBAC4(3)本身无荧光，当进人细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，DIBAC4(3)进入细胞，细胞内荧光强度增加，即膜电位增加表示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低表示细胞超极化。DiBAC4(3)是目前最常用的线粒体膜电位检测荧光探针

钙离子荧光探针FLUO-3AM应用详解

一、Fluo-3AM的理化性质

颜色及形状：橘红色液体

纯度：，大于95%（高效液相）

溶解性：溶于DMSO

吸收波长/发射波长：506nm /526nm(低/高钙)

消散系数：86000/Mcm(506nm)

保存与使用：粉状的FLUO-3AM应保存于-20度以上。建议使用DMSO作为溶媒。在溶解前，FLUO-3AM和DMSO均须放置至室温。溶解过程可能会比较慢。用无水的DMSO溶解的FLUO-3AM长期保存，应严格密封，并保存于-20度。使用前，将保存液放置至室温后再打开。可避免AM探针在长期的保存过程中水解。

二、Fluo-3AM的工作原理

FLUO-3广泛用于长波长的荧光钙指示剂。其在506NM处被吸收，可以被氩离子激光的488nm激发光激发，便于检测。FLUO-3在没有同钙结合的情况下，无荧光产生。但是，在与钙结合后，荧光（526nm）增强至少40倍。Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。Fluo-3 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525-530nm。

三、Fluo-3AM的应用

1、过程概述

用于细胞内钙离子检测时，Fluo-3 AM的常用浓度为5μM。通常用含有5μM的Fluo-3 AM的适当溶液和细胞一起在37℃孵育30-60分钟进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。然后在流式细胞仪上进行检测。

2、Fluo-3AM使用液的配置

100ug的Fluo-3AM，分子量是1219.9。按实际需要的摩尔浓度折算，无水DMSO溶解。一般配置成1~5mM的DMSO储存液。如出现难溶现象，可以用20%的F127的DMSO溶液助溶。

四、注意事项：

1、荧光染料有淬灭问题，应尽量避光保存；

2、实验时注意个人防护，戴手套、口罩；

五、应用举例

2、贮存液的配制（5000μM/L）

按照说明书，计算0.1mg 的摩尔数为0.089μM ，则需加DMSO18uL，微量加样器反复吹打混匀后分装，按说明书要求避光-20度冰冻保存。

（二）应用

每毫升细胞悬液中加入1 uL，则Fluo-3AM的使用终浓度为5μM/L

Hoechst 33258染色

固定液 50 ml

Hoechst 33258染色液 50 ml

抗荧光淬灭封片液 5 ml

说明书 1 份

保存条件：

4℃保存，Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。本试剂盒自订购之日起六个月内有效。

注意事项：

Ø 需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

Ø 需PBS或0.9%NaCl溶液。

Ø 需盖玻片与载玻片。

Ø 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。

Ø 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。

使用说明：

1. 贴壁细胞

A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。

E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。

G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，详细图谱请参考下图。

2. 悬浮细胞

A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。

C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。

E. 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。

F. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

G. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左.

3

. 组织切片

A. 对于任何常见切片，处理至常规可以进行免疫染色时，或完成常规的免疫染色后，即可进行后续的Hoechst染色。

B. PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。可在六孔板中操作。

C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动。

D. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

E. 将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，

Hoechst 33258的吸收光谱和发射光谱，左侧峰为吸收光谱，右侧峰为发射光谱。

DAPI染核

原理：

主要结合dsDNA；结合小沟的AT。DAPI也结合RNA，但其发射峰波长（500nm）要长于DAPI/dsDNA（460nm）。

DAPI dilactate更水溶。在用于组织染色、未固定细胞和组织染色时，下述方法可加以修改。

保存：

10mg/单位，室温避光保存，小瓶内至少一年。制stock液，溶解100uM （DAPI dihydrochloride二盐酸化物分子量为350.3；DAPI dilactate分子量为457.5）DAPI于去离子水中或DMF(二甲基甲酰胺)，4℃避光可保存6个月。

DAPI是诱变剂，水溶液可通过活性炭去除，要安全处理。

染色：

在所有染色完成后进行复染，不需要另外的固定和通透处理。

荧光显微镜复染方法：

1. PBS平衡

2. PBS稀释DAPI stock液至300nM，滴加300μL这种稀释液于细胞上。

3. 孵育5分钟。

4. PBS中涮洗几次，涳干过量缓冲液，抗淬灭剂封片。

FISH复染：

样品在dH2O中洗以去除残留缓冲盐溶液，有助于减少玻片上非特异背景。

1. PBS中稀释至30nM，吸300μL滴于样品上，塑料玻片有助于平均分配染料。

2. 黑暗室温孵育30分钟。

3. 去掉盖玻片，PBS和dH2O中小心盥洗。

4. 去掉过量液体，绵纸在样品边缘小心吸取。

5. 盖上盖玻片，蜡或指甲油封片。或按供应商的指导加抗淬灭剂。

荧光显微镜观察。

Rhodamine 123 染色

中文名称：罗丹明 123

目 的：测细胞内线粒体的跨膜电位

EX/EM： 505/534

染液配制： 罗丹明123 粉剂用甲醇配制成1mg/ml的储备液，100ul/支分装，-20℃保存。染色时用Dulbecco’s PBS缓冲液将其稀释为5ug/ml。

染色步骤：

培养细胞

Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗2～3次(缓冲液预热至室温或37℃)

Rhodamine 123(5ug/ml) 37℃孵育1小时

Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗2～3次

加0.5ml Dulbecco’s PBS，上机测量

Fluo-3-AM 染色 (测细胞内游离钙离子浓度)

染液配制：Fluo-3-AM 50ug溶于45ul DMSO(Fluo-3-AM浓度 1mM)，15ul/支分装，-20℃保存。染色时用15～50mM HEPES缓冲液将其稀释为1～20uM(如1.5ml 为10uM)。

染色步骤：

培养细胞

缓冲液漂洗2～3次

Fluo-3-AM (1～20uM) 37℃或室温孵育0.5～1小时

缓冲液漂洗2～3次

加0.5ml 缓冲液，上机测量。