概述

材料与方法

注意事项

概述

目的:总结并改进细胞体外侵袭实验的操作经验。方法：采用改进后细胞体外侵袭实验分别研究不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱；粉防己碱对HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用；VEGF 对人结肠癌HT229 细胞体外侵袭能力的影响。结果:改进后侵袭试验定位准确，结果清晰。结论：按照作者建议的方法操作，能够缩短实验时间,有助于提高细胞体外侵袭实验的质量。 细胞体外侵袭实验主要应用于各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响及一些抑制血管生成的新药研究,但在具体实验中获得真实、最佳实验结果的图像,并借以说明问题并非简单。很多研究人员在此方面花费了很多时间和科研经费,从刺激实验用的细胞到苏木素染色,看似简单的实验步骤中有很多环节需要研究者注意.

材料与方法

1. 1

Matrigel：Becton Dickinson Compary, - 20 ℃保存；

Tanswell plate：Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直径为8μm；

苏木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。

1. 2 趋化因子的制备　取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞,无血清培养基轻柔漂洗两次; 加入无血清培养基,37℃,5 %CO2 培养24 h～48h，收集细胞培养上清；4 ℃,12 000rpm 离心,10 min ,取上清；0.22 μm 滤膜过滤除菌；分装,在- 20 ℃保存。

1. 3

transwell 培养板准备　所有操作均需无菌操作。-20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃～8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100μl Matrigel 加入冰预冷的300μl 无血清培养基中,充分混均。取上述稀释的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆盖整个聚碳酯膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成胶。已铺好Matrigel的transwell 培养板置于37℃可保存2 周。

1. 4

Matrigel 侵袭实验(Matrigel Invasion Assay)刺激后的各组细胞用PBS 漂洗3 次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5 ×105个细胞/ ml ,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95 %。Transwell 培养板上室加入100μl 细胞悬液( 5 ×104 个) 并加入无血清培养基200 ul 。Transwell 培养板下室加入500μl 趋化因子,37℃,5 %CO2 培养24 h。用湿棉签轻轻擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。小心取出上室,用线拴住,并做好标记,用冰预冷的甲醇固定30 min。苏木素染色1 min。梯度乙醇脱水(80 % ,95 % ,100 %) ,二甲苯透明。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下( ×400) 随机取6 个视野[1 ] 计数,取平均数。重复实验两次。

注意事项

2. 1

NIH3T3 细胞制备的趋化因子与胎牛血清　趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验的实验室比较多,时间较长且实验步骤繁琐。众所周知,胎牛血清中有趋化因子,我们在不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3 细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的,两组迁移的细胞数很接近。在实验时间上，用NIH3 T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1 周,而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为2 d ,实验时间节省了很多。因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3 细胞制备的趋化因子。

2. 2 细胞的准备　所需细胞应处在对数生长期,细胞活力需大于95 %。如果细胞活力小,就会造成细胞穿透能力下降,影响实验结果。

2. 3 擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞　先用干棉签将上室内液体吸去,再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去Mat rigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞,如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞,在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。尤其是细胞为圆形的时候,就会分辨不出是穿过去的细胞还是没穿过去的细胞,对于长梭形细胞来说,穿过去的细胞为长梭形,没穿过去的细胞多为圆形。

2. 4 苏木素染色　上室浸泡在新苏木素中的时间为1 min ,用过多次的苏木素为2 min。在研究粉防己碱对HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用没有将多余苏木素洗去,直接脱水、透明,造成细胞图片背景模糊,细胞不清楚。在作不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验时我们将其置于盛有自来水的烧杯中,反复漂洗几次,将多余苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞图片背景干净,细胞清楚。

2. 5 脱水和透明时间　脱水时间各为1 min ,在二甲苯中的时间不要过长,以2 min～3 min 为宜;尤其是同时操作多个样本时,时间过长就会造成部分聚碳酯膜从上室基底部自动脱落下来,上室间粘连在一起,造成样本混淆,实验失败。建议在最后一步实验时需二人协做,一人辨别并取出样本,一人小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片并及时编号。

2. 6 细胞计数　当实验用的细胞为圆形时,实验人员容易将聚碳酯膜上小孔误认为细胞进行计数。我们在作VEGF 对人结肠癌HT229 细胞体外侵袭能力的影响时,发现HT229细胞很小,很容易将聚碳酯膜上小孔误认为细胞进行计数 。