HLA-G简介

HLA-G的遗传,功能及临床意义(HLA-G多态性 HLA-G表达 HLA-G基因表达 HLA-G生物学功能 HLA-G临床意义)

HLA-G简介

中文名称：人白细胞抗原-G

英文名称：human leucocyte antigen-G;HLA-G

HLA－G是由Geraghty于1987年首次克隆出来的位于6号染色体短臂的一类免疫耐受分子[1]，具有选择性组织分布的特点，表达于母胎界面绒毛外滋养细胞、一些肿瘤细胞系、肿瘤活检组织和一些感染及正常组织细胞，以及心脏移植后的移植物细胞等 。

人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)是位于人第6号染色体短臂上的一群紧密连锁基因群，属于人类一种非经典的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的I类分子，选择性高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养细胞。妊娠被认为是成功的同种异体移植，很多妊娠相关疾病与滋养细胞异常增殖、浸润、胎盘形成不良有关。

HLA-G在母胎界面的表达对母胎免疫耐受和维持正常妊娠有重要作用，但HLA-G的具体生物学作用，尤其是非免疫学功能仍不明确。本研究采用RNA干扰(RNAi)技术，通过我室已构建的针对HLA-G基因的siRNA重组腺病毒载体转染HLA-G高表达的人绒毛膜癌细胞株JEG-3，观察HLA-G表达水平的变化对滋养细胞分裂生长的影响。通过HLA-G对滋养细胞增殖调节作用的研究，发现HLA-G新的非免疫学功能。

HLA-G的遗传,功能及临床意义

孟海英侯一平

HLA-G属非经典的HLAⅠ类分子,与经典的HLAⅠ类分子相比它有3个特点:(1)多态性水平低;(2)体内分布局限于特定组织;(3)由于内含子和外显子间的剪接位点改变可形成4种膜结合型和两种可溶型HLA-G异构体.过去几年大量研究结果表明,HLA-G是一种免疫耐受分子.

人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)G,E和F同属非经典的HLAⅠ类基因(HLAⅠb),是继HLA-A,HLA-B,HLA-C和HLA-E之后发现的第5个HLAⅠ类基因.HLA-G最早由Geraghty等[1]克隆并测序,由于它存在于6.0kb的HindⅢ酶切片段中,被命名为HLA-6.0.1988年McAlpine建议为避免在命名中使用标点符号,将该基因命名为HLA-60.1990年在Bodmer等[2]发布的HLA命名通报中将该基因正式命名为HLA-G.

HLA-G位于6号染色体HLA-A端粒侧,其基因结构与HLA-A,HLA-B和HLA-C相似,但提前出现的终止密码使其编码的蛋白产物胞内段仅6个氨基酸,比经典HLAⅠ类抗原的30个氨基酸明显缩短.HLA-G的这一结构特点,加上启动子区结构与鼠的HLAⅠ类基因Qa相似,提示该基因与Qa基因同源.

HLA-G多态性

1992年Geraghty等发现,在HLA-A和HLA-G之间有一个高度多态的区域,这一区域在某种HLA单倍型时缺失,使两基因之间的距离缩短50kb以上.1993年Morales等报道了3个新的HLA-G等位基因,从而证明HLA-G基因有多态性.

到2000年10月止,共发现14个HLA-G等位基因,其中5个有氨基酸序列异,即G*0101,G*0102,G*0103,G*0104和G*0105N.G*0101包括8个编码序列不同,但没有氨基酸序列差异的等位基因,即G*01011～G*01018.G*0104包括3个类似的等位基因,即G*01041～G*01043.G*0105N在外显子3第1597位,即第130密码子的胞嘧啶缺失使读码框架改变,终止密码在第4外显子起始部位第189密码子提前出现,正常HLA-G1分子跨膜区不能被转录,形成一个可溶型HLA-G分子.从以上资料可以看出,HLA-G的多态性远低于经典HLAⅠ类基因.且HLA-GDNA序列在经典HLAⅠ类分子的功能必需区高度保守,与经典HLAⅠ类核酸高变区相应的HLA-G区域多态性有限[3].关于HLA-G多态性在不同群体中分布的研究结果令人困惑.有研究显示HLA-G多态性在高加索人群和美国黑人间的分布差异有显著性,在美国黑人女性群体中的杂合度可达67%,其中大多数多态性出现于编码α2结构域的序列中[4].有人借助逆转录-聚合酶链式反应分析HLA-GmRNA多态性,发现在高加索和非洲加勒比海人群中,其多态性远低于上述报道,其原因可能是前者的引物选在外显子区,而不是象以前的实验选在内含子区[5].

HLA-G表达

HLA-G分子主要在人胎盘组织中转录,表达于孕卵着床期植入母体子宫内膜的胎盘组织中,而此处恰恰不表达经典的HLA-A,B分子及DR,DQ和DP分子.在绒毛膜外细胞滋养层细胞,包括那些侵入子宫蜕膜的细胞滋养层细胞中HLA-G高表达;而在胎盘绒毛的合体滋养层中,HLA-G表达水平较低.绒毛膜细胞滋养层与绒毛膜外细胞滋养层的分化伴随着细胞表面HLA-G分子表达水平的提高,而在植入前的胚胎或生殖细胞中未见HLA-G表达[6].用灵长类恒河猴进行的实验表明,在妊娠14～19天HLA-G主要表达于侵入母体血管和子宫内膜的细胞滋养层中,而在滋养层腔隙表面的合体滋养层和新形成的绒毛膜中基本上是HLA-G阴性.到妊娠第36天,在绒毛膜合体滋养层中也表达HLA-G分子,母体子宫和胎儿滋养层间也积聚大量HLA-G分子[7].在整个妊娠期间,母胎界面处的滋养层细胞还分泌sHLA-G1.HLA-G分子在胎盘组织中的分布可能反应了它的功能,使母体对同种异体胎儿组织抗原产生免疫耐受.此外,在胎儿的肝,眼,心,肺和肾,及成人的甲状腺,角质化细胞,外周血T细胞和B细胞,脾,肝和肾也可检出HLA-GmRNA,但其水平远低于这些组织中经典HLAⅠ类基因mRNA水平[8].调节HLA-G特异性表达的机理尚不清楚.但在HLA-G基因上游(5'端)未检出经典HLAⅠ类基因共有的作用元件,如NF-kappaB,IRF-1和CⅡTA.在推测的HLA-G启动子区,G*0102,G*0103,G*0104和G*0105N有一个不同于G*0101的单碱基替代,该替代在转录调节中的作用有待进一步研究.从HLA-G上游1.1kb起到启动子区止的范围内有几个单核苷酸多态性,也许这些部位为核因子作用的转录调节区.HLA-G上述有两个干扰素γ(IFN-gamma,IFNγ)作用区,分别是一个A/ICS增强子区和一个候选IFNγ活性作用位点(IFN-gammaactivatedsite,GAS).在干扰素调节因子(interferonregulatoryfactor-1,IRF-1)这两个IFNγ作用区可增强HLA-G转录,而HLA-G分子中该区失效,所以在母胎界面处IFNγ不能上调

HLA-G基因表达

胎盘中存在的另一种细胞因子IL-10,可上调人类滋养层和单核细胞HLA-G表达[10].干扰素也可实验性提高转染鼠滋养层HLA-G基因表达.

HLA-G蛋白产物以两种形式存在,即表达于细胞表面的膜结合型(membrane-boundHLA-G,mHLA-G),以及存在细胞内的胞浆可溶型(solubleHLA-G,sHLA-G).在DNA多态性基础上,HLA-GmRNA包括一个全长的HLA-GmRNA(HLA-G1)和3个跨膜区缩短的HLA-GmRNA(HLA-G2,3和4),及两个无跨膜的异构体,蛋白水平仅观察到1个包括完整跨膜区的mHLA-G分子(HLA-G1)及sHLA-G,未观察到跨膜缩短的HLA-G分子,它们留在内质网中,可能对细胞表面HLA-G1或HLA-E表达起调节作

用[11].HLA-G*0105N基因的表达产物就是一种sHLA-G.膜结合型和胞浆可溶型HLA-G分子都可与细胞内来源的相同肽片段结合.

HLA-G生物学功能

HLA-G分子的功能尚不清楚.有人认为它可能与血管生成和(或)胎盘形成有关,目前普遍接受的观点认为HLA-G是一种免疫耐受分子,可能与母胎耐受及抗感染免疫有关.大量的体内外实验及临床研究已证实这种观点,但也有少数报道否定上述观点,基于HLA-G是一种免疫耐受分子,其在习惯性流产,先兆子痫,感染性疾病,肿瘤和其他免疫相关性疾病发生中的作用,及在防治移植排斥反应中的应用受到关注.1998年在法国巴黎召开了第1届国际HLA-G会议,标志着HLA功能研究的进一步深入,同时也说明HLA-G的重要性[12].3.1抗原递呈功能1994年Onno等提出一种关于HLA-G功能的假设;在不利因素(如感染,转化)的刺激下,HLA-G蛋白的合成被诱导,通过某种机制,受损伤的体细胞被靶向性杀伤,达到免疫清除的目的.实验证实,用热休克蛋白,亚砷酸盐等处理,肿瘤细胞株内各种HLA-G同源异构体转录水平提高,而HLA-A,-B,-E和-F等HLAⅠ类基因的转录水平无明显改变,说明HLA-G分子可能作为一个信号分子调节人类对各种不利因素的免疫应答.此外,mHLA-G和sHLA-G都可与来源于细胞内的相同类型的9肽片段结合,这些9肽片段的锚着残基分别是第2位的亮氨酸或异亮氨酸,第3位的脯氨酸和第9位的亮氨酸.当这3个锚着位点同时被甘氨酸替代时,该肽片段不能与HLA-G分子结合,但这3个锚着位点中任意一个位点的替代,不影响肽片段与HLA-G分子结合[13].与HLA-A2递呈的抗原肽比较,HLA-G分子可递呈的抗原肽种类较少.因此不能排除HLA-G分子具有结合和递呈抗原的功能.3.2HLA-G与母胎免疫耐受胎盘植入期,绒毛膜外滋养层(extravilloustrophoblast,EVT)通过子宫蜕膜向子宫螺旋动脉靠近的过程中,滋养层损伤动脉壁,使胎儿从母体获得足够的血流供应.与其它细胞不同,EVT细胞表达HLA-C,HLA-E和HLA-G3种HLAⅠ类分子,其中高水平表达HLA-G是EVT细胞所独有.虽然在肿瘤及其他组织中也发现有少量HLA-G分子,但都没有观察到象EVC组织中一样的HLA-G积聚.HLA-G分子独特分布可能和HLA-E一样,在母胎免疫耐受中发挥作用.

3.3HLA-G与NK细胞胎盘侵入期,表达HLA-G的胎儿滋养层侵入母体组织,母体NK细胞识别胎儿细胞表面HLA-G的刺激信号产生细胞因子,这些细胞因子调节胎盘生长,发育和分化,并使母体对HLA半异源的胎儿产生免疫耐受.妊娠各阶段子宫的白细胞类别及胎儿组织表达的各种细胞因子受体不同,滋养层与子宫细胞间的作用方式相当复杂,包括各种细胞因子,细胞因子受体,粘附分子,酶和激素,这些因素都随着妊娠阶段不同而发展变化.至少有4种NK细胞表面的杀伤细胞抑制性受体(killer-cellinhibitoryreceptor,KIR)可识别HLA-G分子,它们分别是CD94/NKG2,LIR-1,CD158a/p58.1NKR和KIR2DL4.母体中大量CD16-,CD56+NK细胞浸润子宫蜕膜,在子宫蜕膜基底部,即EVT细胞的侵入部位,NK细胞聚集更为明显,它们与侵入蜕膜的EVT细胞紧密接触.这种NK细胞表达各种识别HLAⅠ类分子的受体,如CD94/NKG2.因此,胎儿细胞表面HLA-G分子可能通过与母体NK细胞表面KIR结合,抑制NK细胞杀伤活性,从而导致母体对HLA半异源性胎儿产生免疫耐受.用蜕膜来源的NK细胞和NK细胞克隆进行的实验证实,HLA-G分子可与母体蜕膜中NK细胞表面受体结合,抑制NK细胞杀伤活性.HLA-G分子与CD94/NKG2受体的作用可被抗CD94/NKG2受体抗体阻断,使表达HLA-G分子的细胞被人体胎盘的CD94/153 NKG2阳性NK细胞杀伤[14].Dorling等[15]研究表明,除抑制NK细胞杀伤活性外,HLA-G分子可抑制NK细胞游走.另一方面,在HLA-G低表达时,EVT细胞以剂量依赖的方式被NK细胞杀伤[16].3.4HLA-G与细胞毒性T细胞据认为HLA-G分子还可通过与细胞毒性T(cytotoxicTlymphocyte,CTL)细胞作用,保护胎儿免受母体CTL细胞杀伤.HLA-G分子与CTL的作用有几个特点:

(1)抗原肽剂量依赖性;

(2)可被抗HLA-G单克隆抗体阻断;

(3)在HLA-E/CD94/NKG2A途径被阻断后,抑制作用依然存在;

(4)HLA-G分子浓度依赖性[17].

在混合淋巴细胞培养实验中,用各种浓度的纯化HLA-G检测其对CTL细胞反应能力的影响,结果表明≥0.1g/ml的HLA-G可抑制30%～100%的异源CTL细胞杀伤活性;0.01～0.05g/ml的HLA-G可使异源CTL细胞杀伤活性提高25%～50%;≤0.001g/ml的HLA-G分子对异源CTL细胞杀伤活性无影响.≥0.1g/ml的HLA-G分子诱导辅助性T细胞2(Thelpertype2,Th2)介导的免疫应答,而0.01～0.05g/ml的HLA-G分子诱导Th1介导的免疫应答[18].且由于α3结构域(第223～229氨基酸)氨基酸序列的差异,使HLA-G分子与经典HLAⅠ类分子构象不同,导致HLA-G分子与CD8结合能力显著高于经典HLAⅠ类分子[19].3.5sHLA-G的功能除mHLA-G,sHLA-G也存在于整个妊娠期母胎接触面及母体血循环中,据认为可能是妊娠期一种特异性免疫抑制分子.1999年Menicucci等[20]发现sHLA-G存在于卵细胞培养液中.2000年Hunt等[21]通过酶联免疫吸附实验用抗sHLA-G的mAb检测,发现sHLA-G存在于妊娠各阶段,孕妇血清中sHLA-G水平明显高于非孕妇,其主要同源异构体是sHLA-G2.Fournel等通过亲合纯化得到与β2微球蛋白结合的sHLA-G1可诱导活化CD8+细胞凋亡.Western杂交结果显示,sHLA-G1可促进活化CD8+细胞表面CD95配体表达.将CD8+细胞与CD95mAbZB4或可溶性CD95-Fc重组体一起预孵育,CD8+细胞的细胞毒性被抑制,提示CD8+细胞凋亡可能是通过CD95/CD95配体途径.sHLA-G1诱导的凋亡依赖于CD8分子参与,抗CD8mAb可阻断程序性细胞死亡[22].3.6HLA-G对HLA-E表达的调节作用HLA-G分子引导序列的肽片段可与HLA-E分子结合而被递呈至细胞表面,通过和NK细胞表面CD94/NKG2受体结合,产生NK细胞抑制信号.

HLA-G临床意义

4.1

HLA-G与先兆子痫先兆子痫(pre-eclampsia,PE)是一种常见的产科综合征,其病理学特征是胎儿滋养层侵入母体蜕膜螺旋动脉缺乏或程度不足.目前尚未发现该病特异性病因,流行病学研究显示先兆子痫具有高度家族性倾向,疾病连锁分析表明胰岛素样生长因子Ⅱ(insulin-likegrowthfactorⅡ,IGF-Ⅱ)和HLA-G是PE的候选基因.PE患者HLA-G基因第8外显子的插入/缺失多态性分布显著性偏离Hardy-Weinberg平衡,表现为杂合度过高.另外,粘附分子异常表达可能也有助于滋养层异常侵入,患者子宫蜕膜中Th1水平也与滋养层侵入特性有关.RNA原位杂交实验显示,正常妊娠时HLA-G表达于EVT,表达水平与侵入蜕膜的深度成正比,在多数PE患者的胎盘中HLA-G缺乏或表达水平降低

[23].结合上述HLA-G分子与CTL作用的浓度依赖,推测低浓度HLA-G分子可能与Th1水平上改变及

先兆子痫的发生有关.新近报道发现HLA-G*0105N纯合型的健康个体[24].也有其它群体遗传学资料显示,HLA-G*0105N的等位基因频率与先兆子痫和宫内发育迟滞无关,提示膜结合型HLA-G分子对

妊娠和胎儿成活可能并非必需.

4.2

HLA-G与病毒感染据认为HLA-G分子可与病毒来源的抗原肽结合,并把它们递呈给母体免疫系统,引起被感染胎儿组织溶解.因此,它可能在人类巨细胞病毒(humancy-tomegalovirus,CMV)感染中发挥一定作用,与习惯性流产有关.已有报道显示,两个患有习惯性流产的妇女是无效等位基因HLA-G*0105N的纯合子.人类CMV可调节HLA-G表达,但这方面的研究结果相当混乱.Onno等研究表明,单核细胞被CMV感染后,由其分化而成的组织巨噬细胞表达HLA-G,而CMV在上调HLA-G表达的同时,下调部分经典MHCⅠ分子表达.急性CMV感染性肺炎患者支气管肺泡的巨噬细胞中也表达HLA-G,在U-373MG星形细胞瘤细胞中也可发现CMV感染与HLA-G(包括sHLA-G)表达上调有直接关系.Jun等[25]认为,人CMV的US3和US6蛋白下调HLA-G表达,US3在内质网与HLA-G直接接触,使HLA-G滞留在内质网;US6通过TAP抑制肽转运.习惯性流产患者NK细胞活性异常增强,这也可能与CMV下调HLA-G表达有关.如果HLA-G是一种免疫耐受分子的假设成立,HLA-G分子应该有助于CMV逃脱宿主的免疫监视[26].此外,有研究显示HLA-G表达于各种感染性肌病的肌纤维中.在正常人和患者的培养成肌细胞中加入干扰素γ,可诱导细胞表达各种HLA-G异构体,提示在感染性肌病和其他局限性免疫应答中,HLA-G分子可能发挥重要功能[27].

4.3

HLA-G与肿瘤免疫HLA-G还可表达于实体肿瘤(如黑素瘤,肉瘤和淋巴瘤).在原发性黑素瘤细胞和转移细胞表面高表达各种HLA-G异构体[28].这些HLA-G分子使肿瘤细胞能逃避NK细胞和CTL细胞的杀伤,溶解作用,这是一种新的肿瘤细胞逃脱免疫监视的机制.非实体肿瘤,绒毛膜癌的发生也可能与HLA-G分子抑制NK细胞的杀伤作用有关.

4.4

HLA-G与移植排斥HLA-G可能通过抑制NK细胞和(或)CTL细胞激活而下调移植排斥反应.HLA-G分子的参与有助于在供受者HLA不相配时提高移植受者生存率,并可能抑制异种移植排斥.HLA-G分子抑制移植排斥反应的机理尚不清楚.除通过调节HLA-E分子表达间接作用于NK细胞,HLA-G还可通过NK

细胞表面的CD94/NKG2受体直接抑制NK细胞的活性.猪内皮细胞表达的HLA-G分子可直接抑制人NK细胞对猪内皮细胞的异源杀伤作用,其抑制作用可被抗CD94抗体阻断[29].同时,HLA-G分子也可抑制NK细胞向移植物内皮细胞移动.此外,HLA-G分子还可抑制异源T细胞增值,降低T细胞对异源细胞的杀伤作用.2000年Lila等[30]对31例心脏移植患者进行253 心脏活检,发现5例HLA-G分子的表达与急性移植排斥反应水平显著降低及缺乏慢性排斥反应有关.