DNA连接酶：(注意：)

匹配粘端的连接：

平端的连接：

提高平端连接效率的方法

掌握DNA片段的体外连接技术。

DNA连接酶：

能催化双链DNA片段紧靠在一起的5’-P末端和3’-OH末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。

E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶

1、E.coli DNA连接酶：

由E.coli基因lig编码，需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为辅助因子。

修复双链DNA上的单链缺刻(nick)，用于连接匹配粘端。

2、T4 DNA连接酶：

从T4噬菌体感染的E.coli中分离得到，由T4基因DNA30编码，需ATP作为辅助因子。

修复双链DNA上的单链缺刻(nick)，用于连接匹配粘端；

连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺刻；

连接平端双链DNA分子。

1、修复双链DNA上的单链缺刻，用于连接匹配粘端。

带匹配粘端的DNA分子靠近时，自发形成暂时的碱基配对，利于连接酶把紧邻的5’-P与3’-OH连接到一起。

不同DNA片断通过匹配粘端的连接。

同一DNA片断通过匹配粘端的连接--自身环化。

2、连接RNA-DNA杂交双链中DNA链上的缺刻。

3、连接带平端的双链DNA分子。

注意：

DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接；

只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick)；

不能连接双链中1个或多个核苷酸缺失所致的缺口(gap)。

E.coli DNA连接酶：连接匹配粘端；

T4 DNA连接酶：连接匹配粘端、平端。

最常用的为T4 DNA连接酶。

匹配粘端的连接：

1）哪些情况下会产生匹配粘端？

同一限制酶切割产生；

同尾酶切割产生。

2）可以用E.coli DNA连接酶、也可以用T4 DNA连接酶。

3）连接效率高。

4）连接后的情况如何？

同一限制酶切割的DNA片段，连接后仍保留该限制酶的识别序列。

两种同尾酶切割的DNA片段，连接后丧失这两种限制酶的识别序列。

平端的连接：

1）哪些情况下会产生平端？

限制酶切割产生；

RNA逆转录合成的cDNA为平端双链；

PCR扩增也能产生，如用Pfu扩增时。

2）只能用T4 DNA连接酶。

3）连接效率低，仅为粘端的1%。

4）连接后的情况如何？

同一限制酶切割的DNA片段，连接后仍保留该限制酶的识别序列，有时还出现另一种新的限制酶识别序列。

不同限制酶切割的DNA片段，连接后丧失这两种限制酶的识别序列。

提高平端连接效率的方法

加大连接酶用量(10倍于粘端连接，1-2U)；

加大平端DNA片段的浓度；

加入10% PEG 8000；

加入单价阳离子(NaCl)，终浓度150-200 mM。