454转录组定义

应用范围和优点

技术流程(流程说明)

454转录组定义

使用罗氏454高通量测序技术进行转录组研究的方法。

应用范围和优点

适用于 对于没有获得全基因组序列的物种的转录组进行研究。优点是可以得到大量的EST长序列。

技术流程

文库构建→→油包水PCR→→454测序

流程说明

一.文库构建

1) 液氮保存新鲜的组织样品，提取高质量的总RNA;

2) 使用Oligo d(T)柱子纯化mRNA；

3) 改进的3’Primer逆转录合成cDNA（SMART方法）;

改进的3’Primer（加入BsgI酶切位点）为：

5'- ATT CTA GAG GCC GAG GC gtgcag d(T)18 VN -3'

(N=A,G,C,or T;V=A,G,or C)

4) BsgI酶切去除PolyA；

5) 双链cDNA片段化；

6) 连接454特有的A & B接头;

7) 使用磁珠筛选去除接头自连片段;

8) 片段筛选，保留一端是A接头、一端是B接头的片段;

9) 氢氧化钠变性，产生单链DNA文库。

 油包水PCR (Emulsion PCR)

1) DNA片段和捕获磁珠混合;

2) 矿物油和水相的剧烈震荡产生油包水环境;

3) DNA片段在油包水环境中扩增;

4) 破油并富集有效扩增磁珠。

二.454 测序

1) PTP准备和清洗;

2) 富集磁珠涂布于PTP;

3) 涂布其他反应成分和包埋磁珠;

4) PTP置于仪器开始测序。