概述

两种试验方法介绍((一) 定血清－稀释病毒法 (二) 固定病毒-稀释血清法)

试验应用

概述

动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。

中和试验 (Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。

两种试验方法介绍

中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合。

(一) 定血清－稀释病毒法

(病毒中和试验)

1.病毒毒价的测定　毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100%死亡时，对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50%时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量 (EID50)。用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。

(1) LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。

测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10-1悬液，3 000r/min离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10、10、10……10，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml，逐日观察记录各组的死亡数。

表2-24　LD50的计算（接种剂量为0.03ml）

病毒稀释度　接种鼠数　活鼠数　死鼠数　积累总计　死亡比　死亡率(%)

活鼠　死亡

10　5　0　5　0　15　15/15　100

10　5　0　5　0　10　10/10　100

10　5　1　4　1　5　5/6　83

10　5　4　1　5　1　1/6　17

10　5　5　0　10　0　0/10　0

10　5　5　0　15　0　0/15　0LD50的计算：按Reed和Muench氏法计算。

高于50%的死亡分数-50%　83%-50%

距离比例= ──────────────────── = ────── = 0.5

高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数　83%－17%

LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数

本例高于50%病毒稀释度的对数－6，距离比例为0.5，称释系数的对数为－1。代入上式：

LgLD=-6+0.5×(－1)=－6.5

则LD50=10，0.03ml，即该病毒作10稀释，接种0.03ml能使半数小鼠发生死亡。

注意：稀释血清法中和试验，计算TCID50或LD50，MID50时，计算公式应改为：TCID50的对数=高于50%血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数。

如按Karber氏法计算，其公式为：

IgLD50（或TCID50）=L+d(S－0.5)

L为病毒最低稀释度的对数，d为组距，即稀释系数，S为死亡比值的和。本例L=－4，d=－1，S=1+1+5/6+1/6=3

IgLD50=－4+(－1)×(3－0.5)

=－6.5

则　LD50=10，0.03ml

注意：用本法计算稀释血清中和试验中和效价时，S应为保护比值之和。

(2)EID50的测定（以新城疫病毒为例）　将新鲜病毒液体10倍递次稀释法释成10-1、10-2、10-3……10-9不同稀释度，分别接种9-10日龄鸡胚尿囊腔，鸡胚必须来自健康母鸡，并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种0.2ml，每个稀释度接种6只鸡胚为一组，以石蜡封口，置37-38℃培养，每天照蛋，24h之内死亡的鸡胚弃掉，24h之后死亡的鸡胚置4℃保存。连续培养5天，取尿囊液作血球凝集试验，出现血凝者判阳性，记录结果，按上述方法计算 EID50。

(3) TCID50的测定（以致细胞病变病毒为例）　取新鲜病毒悬液，以10倍递次稀释成不同稀释度，每个稀释度分别接种经Hank’s液洗3次的组织细胞管，每管细胞接种0.2ml，每个稀释度接种4只细胞管，接种病毒后的细胞管放在细胞盘内，细胞层一侧在下，使病毒与细胞充分接触，放置37℃吸附1h，加入维持液，置37℃培养，逐日观察并记录细胞病毒管数，按上述方法计算TCID50。

2.中和试验

(1) 病毒稀释度的选择　选择病毒稀释度范围，要根据毒价测定的结果而定，如病毒的毒价为10，则试验组选用10－10对照组选用10－10其原则是：最高稀释度要求动物全存活（或无细胞病变），最低稀释度动物全死亡（或均出现细胞病变）。

(2)血清处理　用于试验的所有血清在用前须作56℃30min加温灭活。但来自不同动物的血清，灭活的温度和时间也是不同的。

(3)病毒的稀释　按选定的病毒稀释度范围，将病毒液作10倍递次稀释，使之成为所需要的稀释度。

(4）感作　将不同稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内，第一排每管加入与病毒等量的免疫（或被检）血清作为试验组；第二排每管加入与免疫（或被检）血清同种的正常阴性血清作为对照组；充分摇匀后放37℃感作12h。

(5) 接种　按“病毒价测定”中所述接种方法接种试验动物（或鸡胚、组织细胞）。观察持续时间，根据病毒和接种途径而定。

(6)中和指数据计算　物按Reed和Muench两氏法（或Karber）法分别计算试验组和对照组的LD50（或EID50、TCID50）

试验级LD50　(EID50、TCID50)

中和指数= ──────────────────

对照组LD50　(EID50、TCID50)

假如试验组LD50为10，对照组LD50为10。则中和指数为10，10=1 995，也就是说该待检血清中和病毒的能力比正常血清大1995倍。

(7)结果判定　固定血清―稀释病毒法进行中和试验，当中和指数大于50，表示补检血清中有中和抗体；中和指数在10-50为可疑；若中和指数小于10为无中和抗体存在。

(二) 固定病毒-稀释血清法

（血清中和试验）

1.病毒毒价的测定（微量法）

(1) 病毒的制备　将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变（CPE）达75%以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以3 000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。

(2) 病毒毒价测定　取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10，10，10……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5%CO2温箱37℃培养，从48-14h逐日观察细胞病变，记录结果。

按Reed和Muench两氏法计算TCID50。

56%-50%

距离比例= ────────

56%-33%

本例高于50%病毒稀释度的对数为－6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为－1。

表2-25 TCID50计算（接种剂量50μl）

病毒稀释度　接种数　CPE数　无CPE数　累　计　CPE率　百分数(%)

CPE　无CPE

10　8　8　0　39　0　39/39　100

10　8　8　0　31　0　31/31　100

10　8　7　1　23　1　23/24　96

10　8　5　3　15　4　15/19　79

10　8　4　4　10　8　10/18　56

10　8　4　4　6　12　6/18　33

10　8　2　6　2　18　2/20　10

10　8　0　8　0　26　0/26　0IgTCID50= －6+0.26×(－1)

= －6.3

则TCID50=10，50即病毒作10稀释，每孔接种50μl，可使半数组织细胞管发生病变。

2.中和试验

(1) 血清的处理　动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃；人和豚鼠血清为56℃。加热时间为20-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。

(2) 稀释血清　取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。

(3) 病毒　取－70℃冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作200TCID50稀释（与等量血清混合，其毒价为100TCID50）。如本例病毒价为10，50μl。所以应将病毒作2×10稀释。

(4) 感作　每孔加入50μl病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和1h。

病毒与血清混合，0℃下，不发生中反应，4℃以上中和反应即可发生。常规采用37℃作用1h，一般病毒都可发生充分的中和反应。但对易于灭活的病毒可置4℃冰箱感作，根据不同耐热性的病毒感作温度和时间应有所不同。

(5) 加入细胞悬液　在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。置5%CO237℃温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，14h终判。

由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。

(6) 设立对照　为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照，特别是在初次进行该种病毒的中和试验时，尤为重要。

阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验，阳性血清对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变。

病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照相，先将病毒作0.1、1、10、 100、1000 TCID50稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50μl。然后每孔100μl细胞悬液。 0.1TCID TCID50应不引起细胞病变，而且100TCID TCID50必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。

血清毒性对照相：为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检血清毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检血清（相当于中和试验中被检血清的最低稀释度）。

正常细胞对照相：即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。

(7) 结果判定和计算　当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，血清毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检血清孔出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。

用Reed和Muench两氏法（或Karber法）计算结果，如表2-26

80%－50%

距离比例= ────── =0.5

80%－20%

Ig TCID50=高于50%血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数

Ig TCID50=－1.5－0.5×（－0.3）=－1.35

表2-26　固定病毒－稀释血清法中和抗体效价计算

血清稀释　CPE数总孔数　CPE数　无CPE数　积累　CPE比率　百分数

CPE　无CPE

1:4(10)　0/4　0　4　0　12　0/12　0

1:8(10)　0/4　0　4　0　8　0/8　0

1:16(10)　1/4　1　3　1　4　1/5　20

1:32(10)　3/4　3　1　4　1　4/5　80

1:64(10)　4/4　4　0　8　0　8/8　100则TCID50=10，50μl

因10=1/22，即1:22的血清可保护50%细胞不产生病变，1:22就是该份血清的中和抗体效价。

影响中和试验的因素：

(1) 病毒毒价的准确性是中和试验成败的关键，毒价过高易出现假阴性能，过低会出现假阳性。在微量血清中和试验中，一般使用100-500 TCID50。

(2) 用于试验的阳性血清规戒律，必须是用标准病毒接种易感动物制备的。

(3) 细胞量度的多少与试验有密切关系，细胞量过大或过小易造成判断上的错误，一般以在24h，内形成单层为宜。

(4) 毒价测定的判定时间应与正式试验的判定时间相符。

试验应用

1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试验不但可以定属而且可以定型。

2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间较长。动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。

3.分析病毒的抗原性：毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。

用组织细胞进行中和试验，有常量法和微量法两种，因微量法简便，结果易于判定，适于作大批量试验，所以近来得到了广泛的应用。