正负选择系统是基因打靶的常用筛选方法之一。为了更好地筛选发生同源重组的克隆，1988年Mansour等人设计了正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS), 解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。

理论基础

常用的选择标记基因

正相选择法（positive selection method）

理论基础

同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和 GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因 Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。除了上述方法外，还可用PCR及Southern杂交法进一步筛选及鉴定中靶细胞。

常用的选择标记基因

正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶（neo）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk）及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）。

负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）、SacB、 rpsl（strA）、tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、 ccdB等[14]。

正相选择法（positive selection method）

麻省理工学院Sharp教授的研究组独辟新径，建立了一种新的同源重组选择方法—正相选择法[15]。这种选择法适用于在靶细胞内正常表达的基因的定点突变。其主要程序是：将选择标记基因 neor的启动子和起始密码剪切掉，再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染进靶细胞，可能出现下面几种情况：①打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失；②外源打靶序列随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始密码，整合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻；③虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neor基因的表达；④外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。因此，如用G418筛选，则抗性细胞中将只包含后两种可能情况，根据这两种情况下基因组DNA酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交即可检测出同源重组的克隆。

利用正相选择法，Sharp等对NIH/3T3细胞转化而来的MT-1.4细胞系中的癌基因pmt成功地进行了定点突变。之后不久，哥伦比亚大学的 Schwartzberg等用此方法也实现了另一种细胞癌基因c-abl在 ES细胞中的定点突变。最近，利用与正向选择法相似的原理，Jasin等对小鼠T淋巴细胞系CD4位点亦成功地进行了定点突变。