玻片分类

制作方法(1.取材 2.固定 3.洗涤与脱水 4.透明 5.浸蜡与包埋 6.切片 7.贴片与烤片 8.切片脱蜡及水化 9.染色 10.切片脱水、透明和封片)

玻片分类

实验室所观察的玻片标本可分三种：

切片——生物体上切取的薄片制成；

装片——从生物体上撕取或挑取的材料制成；

涂片——液体的生物材料涂抹而成．

这三种都可以制成永久的和临时的。

永久装片和临时装片制作过程基本一致，只是在染色时需要预先将材料染色，且需防止材料中的细胞脱水变形，所以需要进行封片——用加拿大的树胶密封载玻片和盖玻片，防止水分蒸发。

值得注意的是，所有永久装片制作时都要将材料浸在生理盐水中，目的是保持细胞的形态。

制作方法

这里介绍一种常用的石蜡切片的制作方法：

1.取材

应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。

2.固定

用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。

3.洗涤与脱水

固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不脱尽，苯类不能浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。

4.透明

纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片。

5.浸蜡与包埋

用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃两种，可根据季节及操作环境温度来选用。

6.切片

包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4～7微米，切出一片一片的蜡带。

7.贴片与烤片

用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是明胶。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层明胶，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥，也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。

8.切片脱蜡及水化

干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中，则将切片移至与酒精近似浓度时，即可染色。

9.染色

染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。未经染色的细胞组织其折光率相似，不易辨认。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。染色剂种类繁多，应根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法，还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果。经典的苏木精（Hematoxylin）和伊红（曙红，Eosin）染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色，简称HE染色。经HE染色后，细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。由于苏木精是带阳离子的染料，染液呈碱性，核内染色质及胞质内核糖体等物质对这种染料有亲和性，称嗜碱性；而带阴离子的染料伊红配制的染液呈酸性，对这种染料的亲和性，称嗜酸性。有时不同的组织结构还需要用特殊的染料及染色方法加以显示，称特殊染色。有些细胞组织经硝酸银浸润后，可使溶液中银离子还原成金属银或银粒附着在细胞组织上，呈棕黑色，这种性质称亲银性，而有些细胞组织本身不能使硝酸银的银离子还原成金属银，还需加还原剂才能将银离子还原，称嗜银性。

10.切片脱水、透明和封片

染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95%及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。二甲苯透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。