腺苷酸环化酶

简介

腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)是膜整合蛋白,它的氨基端和羧基端都朝向细胞质。AC在细胞膜内由两个膜整合区,每个膜整合区分别有6个跨膜的α螺旋。在细胞膜内部细胞质面有两个催化结构域，催化结构域中有2个保留序列（conserved region）C1a， C2a，这两个区域主要负责AC的活性。哺乳动物中已发现9个腺苷酸环化酶异构体。由于AC能够将ATP转变成cAMP,引起细胞的信号应答,故此,AC是G蛋白偶联系统中的效应物。

腺苷酸环化酶体系

多肽、蛋白质类及儿茶酚胺激素如肾上腺素、胰高血糖素、胰岛素、促肾上腺皮质素、促甲状腺素等都是通过这一信息传递而发挥作用的。腺苷酸环化酶广泛分布于哺乳动物的细胞膜中，此酶催化ATP生成cAMP并释放焦磷酸。

激素和相应的膜受体结合后，经G蛋白的中介激活腺苷酸环化酶。激素受体嵌在细胞膜的脂双层内，它与激素结合的部位面向细胞外侧。腺苷酸环化酶也居质膜中，位于细胞内侧。

G蛋白位于细胞质膜胞浆面的一种外周蛋白，由3个亚基Gα、Gβ及Gγ，由于α亚基结构和作用不同，可分为激动型G蛋白和抑制型G蛋白两类。

激动型 G蛋白（Gs）未被激活前，Gγ系与GDP结合，呈无活性状态，一旦受体与激素结合后，即可诱发G蛋白上的Gα-GDP 与GTP交换，成为活性状态的Gα-GTP 。同时，Gα-GTP即与Gβγ部分分离，并移动到邻近的βγ腺苷酸环化酶部位，以激活腺苷酸环化酶，后者催化ATP变成cAMP。但Gα-GTP的寿命是短暂的，因为Gα本身具有GTP酶的活性，可以水解GTP为GDP与Pi。又成无活性的Gα-GDP，并返回与Gβγ结合成完整的无活性的G蛋白（a-βγ）-GDP。

另有一类G蛋白抑制型G蛋白（Gi），会抑制I,V,和VI亚型的AC的活性例如胰岛素、生长素抑制素通过Gi使细胞内cAMP浓度下降。但Gi对II和IV型则有正向刺激作用。

另外，Ca离子跟钙调蛋白（calmodulin）也可以激活ACI型与III和VIII型。

腺苷酸环化酶的电镜酶细胞化学实验方法

腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上。它也是一种磷酸酶，能催化ATP形成3'，5'－环磷酸腺苷（cAMP）并释放出焦磷酸。Howell等人（1972）首先用亚胺二磷酸腺苷（AMP－PNP）作底物，成功地对动物细胞中的腺苷酸环化酶进行了定位。现已确认，在未固定和固定的组织中，ATP－PNP是腺苷酸环化酶的专一性底物，在腺苷酸环化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，后者与捕捉铅离子反应，生成一种不溶性的电子密度很高的产物。但铅能在一定程度上抑制酶活性，为克服这一缺点， Fujiomto等（1981）设计了使用二钾亚砜（DMSO）的硝酸铅法。下面介绍的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸铅法。

固定：配制固定液的缓冲液使用0.1M pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液，内含8%蔗糖、5%的DMSO。

固定液配方： 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。对于肝脏来说，1%以上的戊二醛固定时，可导致明显的酶失活。但若加5%的DMSO，酶活性能较好保存。总体来说，多聚甲醛与戊二醛的浓度应因组织而异。一般在0～4℃固定2小时或室温固定1小时。

洗涤：用配制固定液相同的缓冲液漂洗1小时～过夜，期间更换缓冲液数次；而后进行厚切片；

孵育：配方及条件见\\ref{table:Enzyme-7},

作为腺苷酸环化酶特异底物的AMP－PNP在室温中或长期冷冻保存时，ATP、AMP－PN 和AMP－PNP－P等化合物容易增多，应引起注意。左旋咪唑的加入是由于底物AMP－PNP 容易受到组织的碱性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制该酶的活性，在碱性磷酸酶活性高的组织内，左旋咪唑的浓度等因素需特别注意考虑。氟化钠为腺苷酸环化酶的激活剂，应根据组织不同进行前处理后，将氟化钠加入到孵育液中。

后固定：后固定前，必须用不含DMSO的二甲胂酸钠缓冲液进行充分洗涤。

残存的DMSO可以与锇酸反应，产生扩散性的微细颗粒。后固定用二甲胂酸钠缓冲液配制的1%～2%的锇酸。锇酸后固定时对酶反应产物有一定的影响，有人认为固定时间不应超过10min，超过后可引起酶反应产物颗粒变粗变大、扩散，有时由于全部溶出而导致完全没有反应产物的阴性结果。因此认为用锇酸固定时间最好控制在5分钟内。也有用2～4%的戊二醛代替锇酸进行后固定。

对照实验中可除去底物AMP－PNP，也可在对照实验的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。

DMSO的硝酸铅法孵育液配方及条件table:Enzyme-7

孵育液配方：& Tris－顺丁烯二酸缓冲液（pH 7.4） 80mM

蔗糖 8%

氟化 20mM

茶碱 2.0mM

AMP－PNP 0.5mM

硫酸镁 4.0mM

左旋咪唑 2.5mM

DMSO 5%（V/V）

硝酸铅 2.0mM

孵育条件： 孵育液pH 7.4

孵育温度 37℃