| 词条 | 腺病毒包装技术 |
| 释义 | 腺病毒表达系统中的难点主要在于怎么将外源基因表达框或者外源的shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上。由于腺病毒骨架载体比较大（~30kb），而且载体中的一些常用酶切位点几乎都有多个，如果用常规的酶切-连接的方式将外源基因或者shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上，成功率很低，因此，目前的腺病毒表达系统基本上都是用同源重组的方法将外源基因或shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上。 简介腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳细胞中瞬时及高水平地表达shRNA或目的蛋白。其具备以下优点： 1. 宿主范围广。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，除可感染几乎所有人的细胞类型外，还可感染包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。 2. 因腺病毒的感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。 3. 腺病毒具有嗜上皮细胞特性，因目前大多数肿瘤细胞均属于上皮细胞，这使得腺病毒非常适合应用于基因治疗领域。 4. 病毒滴度高，可用于动物水平的实验。 5. 有较好的生物安全性。腺病毒携带的基因不会整合到宿主细胞基因组中；实验中虽然会有一定机率出现RCA（即复制型腺病毒），但由于大多数成人体内都有针对腺病毒的抗体，所以一般危害不大。 腺病毒包装技术要点重组腺病毒的包装制备：重组腺病毒是从由侵染色斑组成单位（pfu）中分离获得的。一个单色斑是线性载体质粒转染后在20×15 cm板上由293A细胞连续侵染后被挑选和扩增形成的。重组腺病毒可通过超速离心纯化，并测定滴度及进行PCR鉴定。纯化后重组腺病毒的滴定浓度为1010pfu/ml，获得的量为2-4 ml。 重组腺病毒的特性：一般的，单个腺病毒通常是在30×150mm细胞培养皿中制备的。 获得量：1×10病毒颗粒/细胞 滴定浓度：1×1010～1×1012个病毒基因组/ml 最终体积：1 ml纯化后的病毒液（储存于PBS） 储存：批量储存的最佳条件为-80°C 表一 腺病毒表达系统与慢病毒表达系统的比较 病毒表达系统 腺病毒表达系统 慢病毒表达系统 病毒基因组 双链DNA病毒 RNA病毒 复制 自主复制 自主复制 感染细胞类型 感染分裂和不分裂细胞； 表达方式 瞬时表达 长时间、稳定表达 表达时间 快（1~2天） 慢（1~3天） 表达丰度 高水平表达 中水平表达 滴度 高达10~10 pfu/ml 最高可达10~10 pfu/ml 克隆容量 8~40 kb 8 kb 免疫原性 高免疫原性 低免疫原性 生物安全性 不整合；有一定机率出现RCA；大多数成人有抗体 整合；有一定机率出现RCL |
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