顺反子（cistron）：即结构基因，为决定一条多肽链合成的功能单位，约1000bp。1955年，美国分子生物学家本泽（Benzer）通过对大肠杆菌的噬菌体T4的rII区基因的深入研究，揭示了基因内部的精细结构。提出了基因的顺反子（Cistron）概念。他发现，在一个基因内部，可以发生若干不同位点的突变，倘若在一个基因内部发生两个以上位点的突变，其顺式和反式结构的表型效应是不同的。

概念

分类(单顺反子 多顺反子)

多顺反子的应用前景

概念

1957年，美国分子生物学家西莫尔·本泽尔(Seymour Benzer,1921--2007)以T4噬菌体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistron）、突变子(muton)和重组子(recon)的概念。顺反子是一个遗传功能单位，一个顺反子决定一条多肽链，这就使以前一个基因一种酶的假说发展为一个基因一种多肽的假说。能产生一种多肽的是一个顺反子，顺反子也就是基因的同义词。顺反子可以包含一系列突变单位──突变子。突变子是DNA中构成基因的一个或若干个核苷酸。由于基因内的各个突变子之间有一定距离，所以彼此间能发生重组，这样，基因就有了第三个内涵──“重组子”。重组子代表一个空间单位，它有起点和终点，可以是若干个密码子的重组，也可以是单个核苷酸的互换。如果是后者，重组子也就是突变子。 顺反子概念把基因具体化为DNA分子的一段序列，它负责传递遗传信息，是决定一条多肽链的完整的功能单位；但它又是可分的，组成顺反子的核苷酸可以独自发生突变或重组，而且基因与基因之间还有相互作用。基因排列位置的不同，会产生不同的效应。

分类

单顺反子

单顺反子（monocistron）：真核基因转录产物为单顺反子，即一个基因编码一条多肽链或RNA链，每个基因转录有各自的调节元件。

真核生物mRNA（细胞质中的）一般由5'端帽子结构、5'端不翻译区、翻译区（编码区）、3'端不翻译区和3'端聚腺苷酸尾巴构成。分子中除G构成帽子外，常含有其他修饰核苷酸，如A等。5'端帽子结构通常有3种类型，即：G（5'）ppp(5')N；G(5')ppp(5')N和G(5')ppp（5'）N。图1b[真核生物mRNA结构示意图b5'端帽子结构式，表示碱基，表示碱基是帽子的化学结构，N右边的m代表核糖2'位羟基的甲基化。真核细胞线粒体中的mRNA无帽子结构。一般认为帽子的功能与翻译的启动有关。许多真核生物mRNA(如珠蛋白mRNA)除去帽子后翻译效率大大降低。5'端不翻译区，也叫前导顺序。不同的真核mRNA的前导顺序长度不同，有的只有10个核苷酸,有的则有200个核苷酸。与原核mRNA相似，真核mRNA5'端不翻译区中常有一段顺序与核糖体小亚基上的18SrRNA的3'端的一段顺序互补并结合，这种结合与真核mRNA的翻译启动有关。

翻译区(编码区)使用的密码子除线粒体（如人、牛和酵母线粒体）外与原核生物mRNA是一样的。真核生物mRNA的起始密码子都是AUG。真核和原核生物mRNA使用的密码子也都有“简并现象”，即几种不同的密码子翻译出同一种氨基酸，但不同的mRNA中简并密码子的利用率是不同的，真核与原核生物之间的差别就更大。mRNA的终止密码子有3个（UAG、UGA和UAA），其功能是停止翻译，一般只用一个终止密码子就能使翻译停止。有的mRNA有2个连续的终止密码子（见）。3'端不翻译区的长短在不同的mRNA上有所不同，β珠蛋白mRNA只有39个核苷酸,而卵白蛋白mRNA则有637个核苷酸。真核生物mRNA3'端不翻译区常有AAUAA(A)或AUUUA(A)等顺序，它们和识别多聚A聚合酶及装配多聚A尾巴有关。除个别组蛋白mRNA外，真核生物mRNA3'端均有多聚A尾巴3'端多聚A尾巴的长度随来源不同而不同,且随mRNA的老化而变短,通常有20～200个A多聚A与mRNA稳定性及mRNA从细胞核转到细胞浆中有关。

多顺反子

在原核细胞中，通常是几种不同的mRNA连在一起，相互之问由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开，这种mRNA叫做多顺反子mRNA。顺反子的概念来自遗传学中的顺反重组试验，是确定交换片段究竟在一个基因内还是属于两个基因的试验，简言之，一个顺反子就是一个基因，多顺反子就是多个基因。真核生物中也有多顺反子，比如C.elegans共有13500个基因，约25%的是多顺反子(polycistronicmRNA)。

mRNA存在于原核和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器（如和）中。RNA病毒和RNA噬菌体中的RNA既是遗传信息的载体又具有mRNA的功能。生物体mRNA种类的多少与生物进化水平有关,高等生物所含的遗传信息多，mRNA的种类也多。生物体内某种mRNA的含量根据需要而有不同，如5龄蚕后部丝腺体的主要任务是快速合成大量丝心蛋白，因而编码丝心蛋白的mRNA含量特别多。有些细菌需要不断适应外部环境，其体内编码某些诱导酶的mRNA的含量也较多。原核和真核生物mRNA有不同的特点：①原核生物mRNA常以多顺反子(见)的形式存在，即一条mRNA链编码几种功能相关联的蛋白质。真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在，即一种mRNA只编码一种蛋白质。②原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的，即转录尚未完毕,蛋白质的转译合成就已开始。真核生物转录的mRNA前体则需经后加工，加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始，工作信息体中蛋白质与RNA之比约为3。③原核生物mRNA半寿期很短,一般为几分钟，最长只有数小时(RNA噬菌体中的RNA除外)。真核生物mRNA的半寿期较长，如胚胎中的mRNA可达数日。④原核与真核生物mRNA的结构特点也不同。

一级结构与功能的关系：原核生物mRNA一般5'端有一段不翻译区，称前导顺序，3'端有一段不翻译区，中间是蛋白质的编码区，一般编码几种蛋白质。如大肠杆菌乳糖操纵子mRNA编码3条多肽链;色氨酸操纵子mRNA编码5条多肽链。也有单顺反子形式的细菌mRNA，如大肠杆菌脂蛋白mRNA。原核生物mRNA分子中一般没有修饰核苷酸，也没有5'端帽子结构和3'端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mRNA的起始密码子(AUG)附近（5'方向上游）的一小段长短不等的顺序，含有较多的嘌呤核苷酸，被称为SD顺序。它能和核糖体小亚基上的16SrRNA的3'端富含嘧啶核苷酸的区域配对结合，有助于带有甲酰甲硫氨酸的起始tRNA识别mRNA上的起始密码(AUG)，使肽链合成从此开始。这段顺序是1974年由J.夏因和L.达尔加诺发现的，所以称为SD顺序，也称核糖体结合部位。原核生物mRNA的编码区一般编码几种功能上相关联的蛋白质，两种蛋白质的编码区之间常有一小段不翻译的顺序，叫做间隔区。有的噬菌体RNA中2个相邻的顺反子共用一段相同的编码顺序，例如，M噬菌体RNA中的溶菌蛋白编码区共225个核苷酸中有189个核苷酸是由相邻两个蛋白质共用的。原核mRNA与真核mRNA一样使用同一套三联体密码子（真核生物线粒体mRNA有例外）。原核生物合成氨基酸的操纵子mRNA的5'端前导顺序上有一段顺序称作弱化子。弱化子具有两种可以互变的构象，其中一种构象是转录终止的信号，能使转录中止（或衰减）。衰减调节是原核生物合成氨基酸的调控方式之一。

多顺反子的应用前景

1、根据已发表的相关序列，分别设计引物，通过PCR技术克隆了一系列构建水稻质体多顺反子定点整合表达载体所需的元件：质体核糖体(16S)RNA操纵元启动子（Prrn）、质体psbA基因3′端终止子（psbA3′）、氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因（aadA）、水稻质体基因组高频同源重组片段(psbC/trnG，大小3362bp)，命名为crDNA、甘露聚糖酶基因（man）、绿荧光蛋白基因（gfp）。构建了水稻质体多顺反子定点整合表达载体pLM21(-psbC-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片5枪，用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选。结果获得质体转基因烟草4株。用PCR、激光扫描和Westernblot等方法检测都证实man、gfp、aadA三个基因且均得到表达，用RFLP证实表达盒整合到烟草质体基因组中。

2、利用脑心肌炎病毒(EMCV)及脊髓灰质炎(Polio)病毒内核糖体进入位点(IRES)，连接mIL-12p40及p35cDNAs和筛选基因新霉素磷酸转移酶(NeoR)，克隆至逆转录病毒载体pGCEN中，使三个基因同时受逆转录病毒载体5′端LTR启动子控制，转录至同一mRNA转录本上，通过不同机制翻译成蛋白质，从而构建成多顺反子逆转录病毒载体，即pGCEN/mIL-12。在LipofectAMINE介导下将pGCEN/mIL-12转染包装细胞PA317，G418筛选，直至出现阳性克隆，挑取抗性克隆，扩大培养，收集上清，用小鼠成纤维细胞NIH3T3测定病毒滴度。然后用重组转录病毒感染小鼠肝癌细胞筛选，直至出现抗性克隆，扩大培养，对阳性克隆进行鉴定。结果是由PA317包装细胞产生的重组逆转录病毒的滴度为5×105CFU/ml，将其感染小鼠肝癌细胞,后经PCR及Southernblot证明，外源基因已整合至小鼠肝癌细胞基因组中，RT-PCR及Northernblot分析外源基因在mRNA水平上的表达，并证实mIL-12p40及p35cDNA和NeoR基因转录在同一mRNA上。ELISA显示mIL-12的表达量48h为10ng/106细胞。并且M45/mIL-12培养上清能刺激人外周血单个核细胞增殖及诱导小鼠脾细胞IFN-γ的产生(160U/ml)。

3、目前一种新的基因治疗策略，即将不同耐药谱基因导入正常骨髓造血干细胞之获得耐药表型，加大造血细胞与肿瘤细胞克隆之间对化疗耐受性的差别，增加骨髓对化疗的耐受性，以便能施行大剂量化疗、多次重复给药使之最大限度清除肿瘤细胞，发挥化疗效，为保护和及时恢复造血功能提供了可行性。

本研究项目中造血干细胞采用的是脐血干细胞[wangjishi,etal.LeukemiaReaearch.2002,26(3)281-288;实验生物学报2001,34(3)227-233]\\外周血CD34+细胞[wangjishi,FangQinetaL.AxtaPharmacologicaSinica.2001,22(10):949-955]和小鼠骨髓细胞，转染靶细胞显示对化疗药物的抗性增加。有效表达，增加了细胞对亚硝基类药物（如BCNU）的耐爱性，证实该基因具有明显的细胞生物学效应。同进通过体外诱导突变技术获得了突变型MGMT，并成功构建到逆转录病毒载体上。本研究为同内首次以RT-PCR方法从人肝组织克隆了06-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）基因，与人类基因文库MGMT基因同源性比为100%，将该基因导入靶细胞后显示有效表达，增加了细胞对亚硝基类药物（如BCNU）的耐受性，证实该基因具有明显的细胞生物学效应。同进通过体外诱导突变技术获得了突变型MGMT，并成功构建到逆转录病毒载体上。

本研究课题构建了国内外尚未报道的含ALDH1、ALDH3基因与IRES-MDRI基因的双顺反子逆病毒表达载体。同时证实了ALDH1、ALDH3均有抗活性环磷酰胺作用。在多顺反子逆病毒表达载体GLNA-MGMT-NEOR-IRES-MDRI中，利用NEOR基因和MDRI的双重作用建立了双标记系统。研究中涉及到了DNA序列分析，乒乓效应，RT-PCR，PCR，NORTHERNBLOT，WESTERNBLOT，FACS，MTT、建立高滴度产病毒细胞体系和安全高效的基因转移系统。