随着人类基因组计划的完成，探究基因组所蕴含的生物学意义，阐明基因组的生物学功能，已经成为生命科学的研究热点。

人类血浆蛋白组计划简介

2001年10月,国际人类蛋白质组组织(Human Proteome Organization, HUPO)在美国成立,并计划启动人类蛋白质组计划

(HumanProteome Project, HPP). HPP的研究目的是鉴定人类基因组编码的全部蛋白质及其功能,揭示:

a.构成各种人类组织不同细胞类型的蛋白质表达谱;

b.蛋白质组翻译后修饰谱;

c.蛋白质组亚细胞定位图;

d.蛋白质一蛋白质相互作用关系图;

e.蛋白质结构与功能联系图等.

包括对不同发育阶段,不同生理和病理状态下蛋白质的空间与时间上表达状况的认识.HPP是继人类基因组计划后又一个

国际化的重大科学研究项目,其首批执行计划包括:人血浆蛋白质组计划(Human Plasma ProteomeProject, HUPO PPP)

和人肝脏蛋白质组计划(Human Liver Proteome Project,HLPP )由于技术手段和数据处理上的复杂性和多样性,使得蛋

白质组研究比基因组研究困难和复杂得多.作为人类蛋白质组研究的"探路者",HUPOPPP的先期(pilot phase)目标是:

比较不同样本收集,处理和储存过程对蛋白质分析的影响;通过分析血浆蛋白质组，比较不同蛋白质组分析技术平台的

敏感性和局限性;比较不同高丰度蛋白去除(depletion)方法,以及去除与否的差异;数据提取,整理和储存的标准化等,

全面认识人类正常血浆/血清中的全部表达蛋白及其在不同生理条件下的变异度。

HUPO PPP由美国科学家Gilbert Omenn牵头,目前有来自世界十多个国家和地区的57个实验室参加.该计划启动阶段

要求所有参加实验室均使用相同的"参考样品"(reference specimens),该参考样本分别由英国,美国和中国按照同一标准提

供,制备成不同人群的混合血浆(EDTA,肝素和构椽酸钠抗凝血)和血清.代表世界上主要人种的参考样本取自部分志愿者,

他们分别属于白种美国人(Caucasian-American ),非洲裔美国人(African-American),亚裔美国人(Asian-American)和

亚裔中国人(Asian-Chinese).在此基础上,使用各实验室不同的技术平台,不同的蛋白质组学实验方案,全面鉴定和分析

正常人血浆/血清蛋白质组.选择血浆作为人类蛋白质组研究的"探路者"主要基于以下考虑:

a.血浆蛋白质组是最复杂的人类蛋白质组,其中包含着不同组织的亚蛋白质组;

b.血浆蛋白取材方便,能够获得足够的研究样本,容易标准化;

c.血浆蛋白的性质具有很大的动态范围;

d.血浆/血清是临床检查最主要的样本来源,对疾病诊断和疗效监测具有重要的意义;

e.多数血浆蛋白的表达水平与其相应mRNA的水平相关性很差,且普遍存在糖基化,磷酸化等翻译后修饰现象,只能从蛋白

质水平上开展研究。

关于血浆蛋白的简介

1.血浆蛋白的定义和分类

血浆蛋白的组成十分复杂,以往把那些在血浆中出现,并在血浆中发挥作用的蛋白质称为血浆蛋白.随着蛋白质组学

研究的发展,目前把血浆中的所有蛋白质统称为血浆蛋白.根据其来源和功能可分为:

a.组成性蛋白,主要指肝脏和小肠的分泌蛋白,它们在血浆中发挥作用,如白蛋白,纤维蛋白原等;

b.免疫球蛋白,血浆中大约含有数百万种抗体;

c."长距离"受体和配体,如胰岛素等生长因子;

d."局部"受体和配体,如IL-8等蛋白质因子;

e.一过性通过蛋白,如溶酶体蛋白酶;

f.组织渗漏蛋白,如心肌球蛋白;

g.异常分泌蛋白,如PSA等肿瘤相关蛋白；

h.外来蛋白,如病毒蛋白等.其中,前两类是血浆蛋白的主要组成成分,属于高丰度,大分子质量和易于检测的蛋白质.目前

被分离,鉴定并用于临床诊断的血浆蛋白多属于此类.

后几类血浆蛋白多为低丰度蛋白,它们种类繁多,性质各异,作用重要,分离和鉴定相当困难.比如,通常在细胞内发挥作用,

但当细胞死亡或损伤后被释放到血浆中的组织渗漏蛋白,肿瘤或其他病变器官释放到血浆中的异常分泌蛋白等,它们对认

识疾病演变过程,分离疾病特征标志和药物靶标具有重要意义。

2.人类已知的血浆蛋白

目前还不知道血浆蛋白的确切种类和数量.保守地估计组成性血浆蛋白约有500种,它们多为糖蛋白,平均每种蛋白质

至少具有5种不同的结构,如前体分子(precusors ),成熟形式(matureforms ),降解产物(degradation products),;(及

不同的剪接体(splice variants)等,预计由5万种不同的蛋白质分子组成;另一部分是组织渗漏蛋白,可能包括全部人类

蛋白质组.如果按5万种基因产物计算,平均每种产生10种不同的结构,就会有50万种蛋白质分子;血浆中出现序列不同免

疫球蛋白的可能性有近千万种,但是它们不会同时在血浆中全部出现.Pieper, Tirumalai和Adkins等采用不同的技术策

略,分别从血浆中鉴定出325,341和490种不同的蛋白质.Anderson等总结了截至2004年初所鉴定的血浆蛋白为1175种。

血浆蛋白质组研究的主要技术策略

由于血浆蛋白组成复杂,蛋白质组学研究技术各有利弊,靠单一技术平台不能达到最佳分离效果.联合使用不同技术

平台(主要包括:去除高丰度蛋白,样本预分离系统,分离系统,质谱鉴定系统),并加以适当改进是目前通常的做法几种主

要的研究策略如下：

a高丰度蛋白去除+色谱分离+2-DE+联合质谱鉴定:Pieper等采集两名健康男性志愿者血清,首先用免疫亲和吸附法去除

血清8种主要的高丰度蛋白;然后经色谱预分离(pre-fractionation),包括离子交换色谱(anion-exchange chromatog-

raphy,AEC)和分子筛色谱(size-exclusion chromatography,SEC);将富集的低丰度蛋白组分(fractions)经二维电泳

(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)分离,得到近3 700个蛋白质点;这些蛋白质首先经MALDI-TOF质谱鉴定,

再将未能鉴定的蛋白质点进一步用LC-MS/MS串联质谱分析.最终,获得了325个完整的蛋白质.

b.鸟枪测序法(Shotgun sequencing),即高丰度蛋白去除+全蛋白酶解+二维液相色谱(阳离子/阴离子交换色谱+反相色

谱)分离+质谱鉴定(离子阱或Q-TOF串联质谱):Adkins等采集女性志愿者血清,首先用protein A/G吸附去除免疫球蛋白,

胰蛋白酶对血浆全蛋白酶解;酶解后经强阳离子交换(strong cation exchange, SCX)和反相(reversed phase)色谱分

离后,进一步经电喷雾液相离子阱质谱(LCQ Ion Trap)鉴定,获得490种不同血浆蛋白,并把蛋白质鉴定效率提高了3一5

倍；

c.血浆全蛋白预分离(色谱聚集+反相高压液相色谱)+组分胰蛋白酶酶解+串联质谱鉴定(LC-ESI-MS-MS或2D-micro-LC+

MALDI-TOF-TOF-MS ) c Beckman公司于2003年下旬推出ProteomeLab PF 2D system完整血浆蛋白预分离系统.血浆蛋白

先经多维色谱分离,各分离组分经胰蛋白酶酶解后直接进行质谱鉴定.克服了2-DE的缺点,简化了信息处理上的复杂性.

d.多重窄pH范围2-DE+联合质谱鉴定(MALDI-TOF+LC-MS/MS):Starita-Geribaldi等通过使用相差1个pH范围的多重固相

pH梯度干胶条,大大提高了传统2-DE的分离效率,经MALDI-TOF + LC-MS/MS联合质谱分析后使蛋白质鉴定的效率增长两

倍,并且改善了极酸和极碱性蛋白质的分离和鉴定效果.

e.非变性等电聚焦预分离+变性等电聚焦预分离+1D分离+质谱鉴定(LC/MS/MS ) ;Giometti等通过实验证明在非变性条

件下(不破坏蛋白质的三级结构)进行二维电泳,分离到的蛋白质仍然保持原始状态,使蛋白质生物功能和蛋白质之间相

互作用的检测成为可能,克服了传统2-DE的缺陷(采用变性条件).Manabe等通过采用非变性二维电泳与变性二维电泳相

结合的方法,成功地从人血浆中分离,鉴定出多个IgG结合蛋白,这一方法将成为研究蛋白质功能的一个有效手段.

f.SELDI-TOF分离+Q-TOF质谱鉴定:表面增强激光解吸/离子化一飞行时间质谱(surfaceenhanced laser desorption/

ionization-time of flight,SELDI-TOF)是一种以固相表面亲和为基础的质谱分离技术.完整血浆蛋白先经过与不同亲

和表面(化学表面芯片和生物表面芯片)结合纯化后,再经过SELDI质谱分离.由于结合蛋白是未经剪切的,很多蛋白质的质

荷比非常接近,因此该技术无法鉴定所分离的蛋白质,需要进一步结合Q-TOF质谱鉴定。由于该技术能够相对简单,快速地

鉴别出不同分析样本的差异蛋白质,尤其是小分子蛋白,因此在血浆蛋白的分离和鉴定中与上述其他技术具有很大的互补

性,已被用于疾病相关的血浆蛋白质组研究中.Petricoin等用疏水型芯片结合并分离了卵巢癌患者血浆相关蛋白,在肿瘤

和健康血清之间发现了5个差异明显的蛋白质峰,它们共同构成卵巢癌诊断模型,用该模型对肿瘤和健康人血浆进行盲筛,

该模型诊断肿瘤的敏感性为100%,特异性为95 %. Li等选用金属离子鳌合芯片结合并分离乳腺癌血浆蛋白,发现3个乳腺

癌特异的差异蛋白峰.用这3个特异蛋白标志盲筛一组乳腺癌和健康人血浆蛋白,乳腺癌检出的敏感性为93%,特异性为91%.

Adam等利用同样的技术策略找到了9个区别前列腺癌和良性前列腺增生与健康志愿者血浆的差异蛋白峰,其敏感性为83%,

特异性为97%.此外,SELDI-TOF技术也在结肠癌,肺癌,食管癌,肝癌等其他恶性肿瘤生物标志物的研究方面取得了较好的结果。

人类蛋白质组组织

人类蛋白质组组织（HUPO）于2001年宣告成立。它积极倡导并推进了“人类蛋白质组计划”（HPP），旨在从细胞、组织和器官整体水平发现和确认人类蛋白质组组织的种类、数量、存在方式、相互作用、修饰状态及亚细胞定位等。这一

计划得到众多国家的积极响应。2002年11月，在法国凡尔赛首届HUPO大会上，宣布先行启动“人类血浆蛋白质组计划”（HPPP）和“人类肝脏蛋白质组计划”（HLPP）两项重大国际合作计划，标志着“人类蛋白质组计划”正式启动。

人类血浆蛋白质组计划

由美国科学家吉尔伯特·欧曼牵头的“人类血浆蛋白质组计划”（HPPP），是生命科学领域第一个人体体液的蛋白质组计划，目前有13个国家的47个实验室参加。其科学目标是全面分析人类血浆和血清蛋白成分，确定不同人种血浆蛋白质的差异程度，通过生物标记方法，确定不同时期和不同条件下的个体差异（包括生理如年龄、性别、经期、劳动作业和病理状态如特定疾病以及一般药物治疗）的改变，我国也派出科学家参与这一合作计划。

展望

虽然蛋白质组技术有了长足的进步和新的,高通量和自动化的分离,鉴定技术平台相继出现,但人类蛋白质组研究尚处在"探路"阶段,其复杂性也许超乎人们的想象.蛋白质组研究中的许多技术"瓶颈"问题还没有解决.血浆蛋白质组研究将会成为新的研究热点,完全解析血浆蛋白质组,阐明每个蛋白质的功能,描绘出蛋白质间相互作用的网络,需要全世界科学家继续努力,任重而道

远.对血浆蛋白质组的深入研究,将为无数疾病患者带来诊治的希望,成为医学发展史上的又一个里程碑.