词条 | TD-PCR |
释义 | 即touchdown PCR,降落PCR。指每一个(或n个)循环降低1℃(或n℃)退火温度,直至达到一个较低的退火温度(touchdown退火温度)。然后以此温度进行10个循环。正确和非正确退火温度1℃差异将造成PCR产物量4倍的差异,如果相差5℃,就会产生4的五次方(1024)倍的优势,因此,相对于非正确产物,正确产物可以得到富集。退火温度起始在高于计算的Tm值15℃左右,再接下来的循环中,退火温度以每次1-2℃逐渐降低,直到Tm值以下5℃,当达到特异的引物-模板结合的Tm值时,扩增就会开始。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时,特异产物会在与非特异扩增的竞争中胜出,成为主导的扩增产物避免非特异扩增产物的出现。此法扩增可利于PCR产物纯化。 平时我们先用高温扩5~10个循环,再用低温扩增 15~25个循环,这样也是广义上的touchdown。原理就在于,温度的升高提高了PCR扩增的特异性,但也提高了引物结合的难度,降低了扩增的效率,因此一开始先用高温扩增,保证扩增的严谨性,待目的基因的丰度上升后,降低扩增的温度,提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低,无法和特异位点竞争) |
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