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词条 RNAi外源筛靶技术
释义

进行RNAi实验时,您是不是会碰到以下问题:

1、 目的细胞暂时不易得到,比如说原代培养的细胞,稀有难得的细胞株或者目的细胞暂时还没有到位;

2、 目的细胞转染效率低(转染效率在60%以下一般都认为转染效率偏低);

3、 目的细胞需要诱导才能表达靶基因;

4、 目前尚无靶基因的抗体。

当这些问题摆在我们面前,而实验又必须继续进行的时候……

可靠的解决方案——RNAi外源筛靶

技术路线:

1、制备至少叁个靶点RNAi质粒;

2、构建靶基因重组真核表达质粒:靶基因与报告基因融合。因为siRNA是在核酸水平起效,所以,一般我们只克隆靶基因CDS区片段。

3、将各RNAi质粒分别与靶基因真核表达质粒瞬时共转染入工具细胞。

(1)通过荧光显微镜检测实验组相对于阴性对照组(阴性对照siRNA+靶基因真核表达质粒)报告基因的表达水平下降程度;

(2)用报告基因抗体进行WesternBlot检测,来间接反映靶基因siRNA的抑制效率。

参考文献:

1. Takeshi Kawauchi, Kaori Chihama, Yo-ichi Nabeshima and Mikio Hoshino. Cdk5 phosphorylates and stabilizes p27kip1 contributing to actin organization and cortical neuronal migration. Nature Cell Biology, volume 8, number 1, January 2006:17-31.

2. Irena Crnkovic-Mertens, Julia Semzow, Felix Hoppe-Seyler, Karin Butz. Isoform-specific silencing of the Livin gene by RNA interference defines Livinβas key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cells. J Mol Med (2006) 84: 232–240.

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更新时间:2025/3/14 1:42:09