词条 | RNAi外源筛靶技术 |
释义 | 进行RNAi实验时,您是不是会碰到以下问题:1、 目的细胞暂时不易得到,比如说原代培养的细胞,稀有难得的细胞株或者目的细胞暂时还没有到位; 2、 目的细胞转染效率低(转染效率在60%以下一般都认为转染效率偏低); 3、 目的细胞需要诱导才能表达靶基因; 4、 目前尚无靶基因的抗体。 当这些问题摆在我们面前,而实验又必须继续进行的时候…… 可靠的解决方案——RNAi外源筛靶技术路线:1、制备至少叁个靶点RNAi质粒; 2、构建靶基因重组真核表达质粒:靶基因与报告基因融合。因为siRNA是在核酸水平起效,所以,一般我们只克隆靶基因CDS区片段。 3、将各RNAi质粒分别与靶基因真核表达质粒瞬时共转染入工具细胞。 (1)通过荧光显微镜检测实验组相对于阴性对照组(阴性对照siRNA+靶基因真核表达质粒)报告基因的表达水平下降程度; (2)用报告基因抗体进行WesternBlot检测,来间接反映靶基因siRNA的抑制效率。 参考文献:1. Takeshi Kawauchi, Kaori Chihama, Yo-ichi Nabeshima and Mikio Hoshino. Cdk5 phosphorylates and stabilizes p27kip1 contributing to actin organization and cortical neuronal migration. Nature Cell Biology, volume 8, number 1, January 2006:17-31. 2. Irena Crnkovic-Mertens, Julia Semzow, Felix Hoppe-Seyler, Karin Butz. Isoform-specific silencing of the Livin gene by RNA interference defines Livinβas key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cells. J Mol Med (2006) 84: 232–240. |
随便看 |
百科全书收录4421916条中文百科知识,基本涵盖了大多数领域的百科知识,是一部内容开放、自由的电子版百科全书。