Raf激酶抑制蛋白（RKIP）是磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族的一个成员，PEBP这个高度保守的家族已经发现了二十几年，从植物到哺乳动物都有发现。Yeung发现了PEBP能与Raf-1结合，后来证实PEBP共有4个亚类，其中能与Raf-1结合的就是RKIP，属于PEBP-1。尽管目前RKIP确切的细胞功能和分子生物学机制还没有阐明，但是不断出现的实验数据使它在细胞信号调控网络中的作用受到了人们的广泛瞩目，RKIP已成为生命科学领域中的一个新的研究热点。

1 RKIP蛋白基因表达与其功能

人RKIP基因定位于染色体12q24.23，其mRNA长1507bp，由4个外显子转录产生。免疫组织化学分析显示，在许多组织中RKIP主要定位于细胞质及质膜上[[3]]。人的RKIP在多种组织和不同类型细胞都有表达，如脑胶质细胞，浦肯野细胞以及脑皮层和脑海马层；生殖系统的精子细胞、睾丸上皮细胞、附睾上皮细胞、前列腺、输卵管、卵巢、子宫，胰岛B细胞和胰岛多肽分泌细胞等[[4]]。磷酸化的RKIP结合中期染色体的中心体以及着丝点区域，从而可能参与调节染色体的分割和有丝分裂的进行。RKIP的丢失破坏了细胞稳态，导致肿瘤等疾病的发生[[5]]。Fu等人研究表明RKIP可以作为前列腺癌转移的标志物，这体现了RKIP在实际临床中的作用[[6]]。天津医科大学的Li HZ等人研究表明RKIP是人上皮细胞卵巢癌的转移抑制基因[[7]]。RKIP的功能下降可能影响肿瘤转移、血管发生、抗凋亡能力以及染色体的完整性。RKIP的衰退可能同样影响心脏、神经系统的功能，影响精子发生、生殖行为等。

2 RKIP与传导通路

2.1 RKIP与Raf-1/MEK/ERK信号转导通路

在Raf-1/MEK/ERK信号传导通路中，有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase ,MAPK)和细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulated kinase ,ERK）最初是同一激酶，后来随着这类激酶数量猛增，MAPK通指所有这类激酶，ERK特制p44和p22这一亚家族。激活MAPK的激酶是MEK，MAPK被激活后能刺激AP1等转录因子产生生物学作用。这条通路对细胞增殖、分化、凋亡、和迁移都有重要作用[[8]]，它的调节失常可能与人类包括癌症在内的很多疾病的发生发展都有关系[[9]]。在寻找Raf-1的调控蛋白过程中，Yeung等[[10]]报道，RKIP能结合Raf-1，并且干扰下游的MAPK通路。他进一步研究证明过表达RKIP可以竞争性抑制Raf-1的下游靶点MEK。学术界的争论不可避免，Trakul等人发现RKIP可以抑制Raf-1的活性，但是RKIP基因敲除后，Raf-1信号途径并没有明显的激活作用[[11]]。他指出内源RKIP是通过选择性调控Raf-1的激活，而不是破坏MEK和Raf-1的相互作用来抑制MAPK通路。当Raf-1富集到质膜后，RKIP与其结合，阻止Raf-l与PAK(p21-activated kinase)结合，从而阻断PAK和丝氨酸蛋白酶对Raf-l的磷酸化。Houben进一步的研究表明RKIP在麦克尔细胞癌对MAPK激酶传导途径中不能起到关键作用，而且RKIP的缺失也不能挽救ERK信号传导的缺失，他认为RKIP在MAPK的传导通路上起到调节器而不是抑制器的作用[[12]]。RKIP被PKC介导磷酸化后同Raf-1的结合明显下降，但是用其它氨基酸（Glu）替代磷酸位点(Ser-153)并不能使RKIP和Raf-1的结合下降，这说明是磷酸基的立体结构阻碍了它们的结合，不是负离子发挥的作用[[13]]。此外，PKC可以直接调节Raf，其机制是和RKIP途径不同的。以上发现说明了RKIP调节Raf的机制要比预计的复杂的多，有待科学家更加深入的研究。

2.2 RKIP与G蛋白偶联受体信号转导通路

G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors，GPCR)有800多个成员，组成了细胞膜最大的受体家族，这些受体控制了很多基本的生理过程，比如神经传递，激素、酶的释放，炎症和血压调节等等[[14]]。GRK-2(G protein-coupled receptor kinase-2)是G蛋白偶联受体的负反馈抑制因子[[15]]。GRK-2磷酸化GPCR后，使之与活性的G蛋白脱离并开始内化，从而使G蛋白信号失活。Lorenz等[[16]]证实RKIP是GRK-2的生理性抑制因子，它能够与GRK-2的氨基末端结合，从而抑制后者对GPCR的磷酸化。PKC对RKIP(Ser-153)的磷酸化使RKIP与Raf-1脱离，并转而与GRK-2结合，抑制GRK-2的活性最终增强了G蛋白偶联受体信号，因此RKIP对G蛋白偶联受体信号转导通路具有正向调节作用。在RKIP基因敲除的心肌细胞中，b肾上腺素受体刺激的cAMP水平和收缩能力都降低，使RKIP的这种调节信号传导的途径得到了生理实验的证明。

2.3 RKIP与NF-kB信号

除对Raf-1/MEK/ERK和G蛋白偶联受体信号通路的调控外，RKIP还参与了对NF-kB信号通路的调控[[17]]，并且这种调节作用不依赖于MAPK信号传导级联系统。转录因子NF-kB家族可以通过协调众多基因的表达，控制免疫、应激等反应。抑制RKIP能增强NF-kB的转录，而过表达RKIP能减少NF-kB基底水平的转录[[18]]。RKIP可以抵抗NF-kB对TNF-α和IL-1β刺激的反应，RKIP还影响到了NF-kB的上游，抑制诸如NIK,TAK1，IKKα/β等多种激酶。这种实验结果是在体外通过超量表达RKIP水平得到的结论，只有在基因敲除实验和体内实验的结果出来后才能让我们更加确切的了解RKIP在NF-kB信号传导中的作用。

综上所述，RKIP在Raf-1/MEK/ERK、G蛋白偶联受体和NF-kB信号通路中发挥关键的调控作用，而这些信号通路在细胞生长、增殖、分化和肿瘤发生等多个过程中都发挥重要的调节作用。我们已经明确RKIP在许多不同细胞类型中都有表达，并且表达的量也有很大的不同，除Raf-1、GRK-2和NF-kB上游激酶(NIK、TAK1、IKKa和IKKb)已被证实为RKIP作用的靶标外，很有可能还存在其他的RKIP作用靶物对其他信号通路产生影响，这还有待于进一步探讨。（图1）

图1 RKIP 调控的信号途径

3 RKIP与凋亡

3.1 细胞凋亡简单介绍

凋亡又被称为细胞程序化死亡，包括肿瘤细胞在内的大多数细胞都存在受到一定的刺激而引起死亡的现象。凋亡激活失控可以导致一系列的疾病包括癌症以及自身免疫病等[[19]]。细胞凋亡涉及了细胞支架破坏，细胞固缩，细胞核和染色体DNA浓缩和断裂细胞膜起泡，核酸内切酶的激活，膜性凋亡体的形成等等。调节和执行凋亡细胞死亡是由一个半胱氨酸蛋白酶的家族完成的，它们有门冬氨酸的种属特异性，被称作caspases。目前已知道三个主要的细胞凋亡路径：一是死亡受体信号途径，涉及到了肿瘤坏死因子（TNF-a），TNF相关性凋亡介导配体（TRAIL）,Fas配体（FasL）[[20]]，当死亡的配体结合到它们同族受体上，从而引起的凋亡；另一种凋亡途径涉及到了线粒体内膜的损坏和caspses-9的激活；还有一种是通过内质网信号传导通路，包括非折叠蛋白反应和钙离子起始信号等机制, 内质网应激可特异性激活caspase级联最终导致细胞凋亡。事实上，目前大多数化疗药物都是通过诱导细胞凋亡清除肿瘤细胞的[[21]]，细胞凋亡路径的破坏导致了耐药的产生。

尽管先前的研究表明了RKIP调控ERK和NF-kB信号传导途径，但是目前RKIP究竟怎样调控抑制凋亡的刺激尚为明确。通过RKIP可以抑制性调控ERK和NF-kb的途径，很可能这些途径改变的基因产物控制着细胞的存活，保护细胞免遭凋亡。这两个途径和它们相关的转录因子（NF-kb和AP-1）调节了一些与凋亡有关的蛋白如Bcl-2，Mcl-1，TNK-a和IkBa[[22]]等，正因为有这些关联，我们可以推测改变凋亡相关基因产物的表达是增加RKIP提高凋亡敏感性的直接原因。Zuo H Y等人研究表明在电磁诱导海马神经元死亡和凋亡过程中，过度激活的RKIP调控的ERK通路起了重要作用[[23]]。在前列腺细胞和黑色素瘤细胞超量表达RKIP可以抑制NF-kb并上调TRAIL受体DR5（death recepter 5），使TNF关联的凋亡敏感，导致TRAIL介导的细胞凋亡。

图2 RKIP促进药物介导细胞凋亡途径

3.2 RKIP抑制NF-kB调控凋亡

NF-kB是rel转录因子家族的成员，参与介导了许多生物学活动，比如炎症、免疫反应、细胞增殖以及细胞凋亡等等。NF-kB通常在细胞浆中和它的抑制因子IkB结合，IkB通过非共价键结合并掩盖了NF-kB的核定位信号区，达到阻止NF-kb核转录的作用。IkB被IKK复合体磷酸化、泛素化后，在蛋白酶体降解，随后NF-kb易位到细胞核。它参与了众多基因的转录子调节并且产生种种生物学活性[[24]]。这些基因被NF-kB和其他的炎性因子(IL-1, IL-6, IL-8, 和 TNF-a)，抗凋亡因子c-IAPs(c-IAP-1和-2)，Bcl-2家族成员(Bcl-2, Bcl-xL,和 Mcl-1以及负性调控NF-kB的物质调控。因此，NF-kB可以调控促凋亡和抗凋亡基因(如Bcl-xL和Bcl-2)的表达，依靠刺激和细胞类型的不同产生不同的生物学结果，Jazirehi等人发现在霍奇金细胞系中用利妥昔单抗上调RKIP的表达可以抑制NF-kB途径22（图2），降低抗凋亡基因的表达，改变了抗凋亡和促凋亡信号通路的平衡。因此，药物抵抗的淋巴瘤B细胞系变得对药物介导的凋亡敏感。令人意外的是在非肿瘤细胞观察不到RKIP调控NF-kB以及对死亡配体的敏感，但是PEBP另一个家族成员hPEBP4同样抑制Raf-1/MAPK途径却可以阻滞凋亡[[25]]。

3.3 RKIP抑制AP-1表达调控细胞凋亡

激活蛋白-1（activating protein-1，AP-1）转录因子参与了细胞存活和凋亡途径。一些AP-1蛋白如c-jun在一系列激刺激下被早期激活的基因编码，另一些在翻译后加工来增加转录的活性[[26]]。研究表明这种蛋白家族扮演了各种不同的角色，例如c-jun在紫外线诱导凋亡中的反应[[27]]，还有研究表明c-jun在保护紫外线诱导细胞死亡的作用。两种模式可以表明AP-1如何参与影响细胞生存和死亡。第一是AP-1诱导可以导致不同的基因比如FasL和Bim的转录，这些产物可以决定一个细胞是存活还是凋亡。第二种模式推测AP-1做为一个内环境稳定调节因子，维持细胞在一个有限增殖的状态。环境因素可以改变AP-1的活性，改变存活基因和凋亡基因与它的平衡，这样AP-1的活性就决定了细胞的存活还是凋亡。根据报道RKIP可以抑制Raf-1/MEK/ERK通路调节的AP-1的活性1，因此可以推测通过RKIP抑制AP-1的活性会导致抗凋亡蛋白表达的改变，减弱了这些蛋白抗凋亡的活性，这样细胞就会对外界刺激凋亡信号更加敏感。在Jazirehi等人的利妥昔单抗研究中，发现利妥昔单抗在治疗霍奇金淋巴瘤中引起Raf-1/MEK/ERK通路的抑制和下游活性AP-1结合DNA的抑制（图2），AP-1的抑制导致了Bcl-xL转录的抑制，使细胞对药物介导的凋亡敏感。很大程度上Raf-1/MEK/ERK通路的抑制与利妥昔单抗诱导RKIP的表达有关。

很明显，RKIP抑制NF-kB和ERK通路或者是它抑制两个通路中的任意一个可能足以引起凋亡信号的执行。这意味着在RKIP介导下ERK和NF-kB通路抑制，NF-kB和AP-1的局部转录子活性破坏可能放大凋亡信号。虽然利妥昔单抗介导了RKIP表达和ERK的抑制，但是单独在淋巴瘤细胞应用利妥昔单抗不能检测到明显的凋亡。然而，这些细胞表现出可以提高化疗介导凋亡的敏感性。在前列腺癌细胞系用RKIP转染后同样可以观察到提高药物抵抗细胞株化疗敏感性的作用[[28]]。值得注意的是，过量表达在药物敏感和药物抵抗细胞株RKIP可以在没有药物的情况下引起凋亡。因此，RKIP介导的生物学结果可能因细胞种类而不同，或者细胞分化阶段不同，细胞内的信号分子激活状态不同有所变化的。

3.4 RKIP通过GRK-2在凋亡中的起到的调控作用

RKIP的ser-153被PKC磷酸化后，阻断GRK-2的活性。而GRK-2对GPCRs的起负反馈调节的作用，这样RKIP就可以通过GRK-2影响了细胞信号的调控，它和GPCRs存在正反馈关系。GPCRs的激活导致了RKIP同Raf-1的分离。癌细胞缺乏GPCRs激活的情况下，RKIP可能联合Raf-1和IKK调节存活通路，这也于RKIP表达的水平有关。肿瘤细胞无疑会选择低表达RKIP的水平来维持细胞存活，诱导RKIP的表达会改变细胞死亡途径的平衡。然而，有活性的肿瘤细胞可以对GPCRs的激活做出反应，利用RKIP来维持细胞的激活和刺激，提高药物诱导凋亡的阈值。从这里可以看出，人为改变RKIP的水平可以对肿瘤细胞产生破坏作用。

4 结论

分子靶向治疗逐渐成为现代肿瘤学的一个突出的特征，引起癌症细胞程序化死亡（凋亡）就是一个最终的目的。因此，引起凋亡的分子机制的决定了治疗的有效性以及药物的组成。RKIP同细胞特别是肿瘤细胞的凋亡存在密切关系，提高RKIP的表达和药物调控凋亡存在正相关性，揭示了提高RKIP的表达能使药物直接介导凋亡或间接提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。并且RKIP在信号传导上存在不同途径（Raf-1/MEK/ERK, IKK/IKB/NF-kB, GRK-2)，这些通路可能就是潜在的治疗靶点。今后描绘出RKIP转录水平的调节，鉴定出可以控制或（和）抑制RKIP表达的物质是就是我们的工作。RKIP作为转移抑制基因有很大的临床意义，这不只是让我们找到了早期诊断的标记物，更是因为它为肿瘤转移找到了治疗干预新的靶点。更深入的了解RKIP如何在肿瘤细胞调控表达，它如何直接的影响了凋亡和信号传导等等，将为提高治疗肿瘤水平发挥理想的作用。

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